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遗传不稳定是肿瘤及遗传性疾病发生的重要原因之一。对遗传不稳定的研究表明其发生机制具有多样性，DNA复制保真度的降低、DNA修复系统的障碍、细胞周期DNA损伤校正点（DNA damage checkpoint）功能的紊乱都可成为其发生的原因。 对遗传不稳定的进一步研究还发现细胞在受到离子辐射、致癌物（如烷化剂）攻击后，也可产生延迟发生遗传不稳定。本实验室曾证明烷化剂甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG）可诱发vero细胞的遗传不稳定状态，表现为延迟发生的非损伤部位DNA突变率的增加（非定标突变）。用0.2μmol/L MNNG处理vero细胞2.5小时后，继续培养12小时，将含有靶基因SupF tRNA的穿梭质粒pZ189转染入细胞并复制48小时，发现在未受MNNG直接攻击过的穿梭质粒pZ189中存在较高的突变率。非定标突变表现出特定的突变谱并具有时相特征。实验还表明非定标突变中DNA复制的保真度下降，并伴有DNA聚合酶β表达水平的改变。进一步的研究发现细胞内信号转导系统的激活和基因表达的改变是非定标突变发生中的重要事件。 结构特异性核酸酶瓣片内切酶FEN-1（flap endo/exonuclease-1）具有对DNA复制和修复都必需的双重功能，并且在维持细胞的遗传稳定性方面也起着重要作用。在DNA复制过程中，FEN-1参与了后随链冈岐片段前方RNA引物的切除；在DNA修复中，FEN-1参与了碱基切除修复（base excision repair, BER）中的长补丁修复（long patchBER）途径，以及部分双链断裂修复（double strand break repair）以及紫外线损伤的修复过程。对酵母中FEN-1同源基因rad27突变体的研究则发现，该突变体存在较强的增变表型，并在遗传不稳定相关基因Canr，Lys-中主要以重复性突变（DuplicationMutation）为特征，rad27突变体还表现出质粒及基因组微卫星和小卫星序列的不稳定现象。所以，从rad27突变体的以上增变表型，可以认为FEN-1是细胞遗传稳定性的重要相关基因之一。 为研究FEN－l在人类培养细胞的DNA复制和维持遗传稳定性方面所起的作用，以及与非定标突变形成的关系，本实验采用反义核酸技术，将人FENI表达质粒hPET－FCH的 NCo和 BamH双酶切得到 1084hp基因片段，反向克隆到经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp－，得到hFENI 反义表达质粒pMAMneoAm－FNB叫各pMAMneoAmp－FNB转入FL细胞，得到FEN］基因表达被阻断的哺乳动物细胞株FL－FEN－l。在地塞米松诱导下，FL－FEN＊－细胞总 RNA经 RT－PCR扩增得到 242 hp的预计DNA片段，说明FENj基囚的反义mRNA片段得到较强的表达，进一步的表型研究则发现FLFEN刁－细胞的DNA复制过程和遗传稳定性状况发生了改变。 FLFEN叫 在 10 u mol／L地塞米松的诱导下，细胞生长速度明显h降，细胞倍增时间 T。为 3．03d。而对照FL利 FL－M细胞倍增时间 T。分别为 2．03d＃112．22d。与 FL－M相比，FLFEN叫－细胞在第4大开始生长明显受到抑制（P＜0刀5），并在此后持续受到抑制（A0刀1）。采用流式细胞仪，在12 h和扣h二个时相，对经相同同步化处理后的 FL－FEN1－细胞进行了细胞周期测定。在 12 h时，FLFEN、厂细胞｝ DNA合成的进程受阻，表现为 S－期细胞的比例与对照细胞相比明显较低。24 h时，卜LFEN－l 细胞的 GO－GI fib细胞呈高比值，S－沏细胞的比例与对照细胞无明显差异，但 GZ。MFP细胞的比例明显较低，只有极少数的细胞进入GZ－M州，人部分细胞处了GO－01 )uh和S期，这表明此时卜卜陀付1 细胞虽然能进行＊＊A的合成，但无法完成S期的整个过程而进入 GZ－M期，并在 GI fill山现了停滞。以上结果说明 FENI基冈被阻断后，将延缓哺乳动物细胞进入利进行 DNA合成的进材，并使人部分细胞停留了GI Vb。 在由穿梭质粒pZ189介导的细胞囱发失变和 MNNG诱导的非定标夹变检测中发现，穿梭质粒pZ旧9质粒在FLFEN刁－细胞中复制后，其中巴基冈SopF tRNA的囱发突变频率为19．IX 10‘，而对照细胞队羽IF卜M细胞中…F爪＊A基冈的自发夹变频率分别为 2．gX10－‘和 3．0X10－‘，但 FL－FEN－l－细胞经 MNNG诱导后在穿梭质粒pZ189中的Sop尸t＊＊A基冈上的非定标夹变频率与对照细胞并无明显差异，这表明由FENI阻断造成的突变频率于l－高与细胞在受低浓度MNNG攻击后发生的非定标夹变可能通过不同的途径形成。 穿梭质粒 pZ旧9转染 FLFEN－1－细胞及经 0．25 u mol／L MNNG诱导的 FLFEN1后，其靶基因 SopF tRNA ％变的夹变谱的分析发现，自发夹变中进行测序分析的 23 2个突变于共含有37个点突变，其中碱基转换占32％，碱基颠换占68％。在MNNG诱发的非定标突变中进行测序分析的 16个点突变突变子共含有 24个点突变，其中碱基转换占25％，碱基颠换占75％。分析还发现，在FLFEN十细胞自发突变和非定标突变含有单碱基替换突变的突变子中，碱基颠换的发生率极高，而在FLFEN－l－细胞?