背景缺氧对包括鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)在内的恶性肿瘤的血管形成、肿瘤增殖、耐药、转移及凋亡等多方面显著相关。但缺氧导致肿瘤恶性转化的机制到目前为止还不是很清楚。已有研究证实核转录因子HIF-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)在缺氧引起的肿瘤生长和恶性进展中起着枢纽作用。我们在鼻咽癌前期研究中发现,端粒酶及其亚单位(telomerase catalytic subunit, hTERT)在包括鼻咽癌在内的绝大多数恶性肿瘤中高表达,端粒酶高活性是导致恶性肿瘤无限增殖、复发转移的重要原因。目前研究发现,缺氧所导致的上调肿瘤生长、转移及化疗耐药作用有可能是通过上调肿瘤细胞端粒酶活性实现的,且核转录因子HIF-1在调节中起着关键作用。基于鼻咽癌与端粒酶的密切关系,本研究拟探讨缺氧对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性的作用以及对鼻咽癌细胞增殖、转移及化疗耐药等生物学行为的影响；siRNA干扰HIF1α后对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性抑制作用及对鼻咽癌细胞增殖及转移抑制、逆转耐药的影响。进一步为肿瘤缺氧提供新的见解,作为癌症治疗的新靶点。目的探讨缺氧及干预因素对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性的作用以及对鼻咽癌细胞增殖、转移及化疗耐药生物学行为的影响。研究内容和方法1.细胞培养及缺氧处理5-8F和CNE2细胞在标准状态下(5%C02、37℃)培养于含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL)的RPMI-1640培养基中。倒置显微镜下观察细胞的形态。常规使用0.25%胰酶(含EDTA)消化传代。所有实验均选用处于对数生长期细胞。缺氧处理,细胞经实验处理后,由常氧C02培养箱转移至已调节稳定的三气培养箱中(包含1%O2,5%CO2,和94%N2)。2.缺氧对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性作用的影响2.1缺氧对鼻咽癌细胞HIF1α和hTERT基因表达的影响5-8F和CNE2细胞培养于6孔板,将未融合的细胞缺氧培养0h-72h,采用SDS裂解液提取细胞总蛋白,BCA法对蛋白进行定量,免疫印迹法检测各个时间点(0、4、8、16、24、48、72h) HIF1α和hTERT蛋白的相对表达量。以β-actin为内参。2.2鼻咽癌细胞瞬时转染HIF1α-siRNA并检测其转染率5-8F和CNE2细胞以2～2.5×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板(96孔板为5×103个/孔),12小时后细胞密度达到30%～50%,更换无血清培养基。按照说明书,采用Lipofectamine2000转染siRNA, siRNA转染的终浓度为30nM。 Negative-siRNA标记有Cy3荧光,6h后荧光显微镜观察转染细胞,流式细胞仪检测转染率,每批细胞设3个复孔。2.3筛选沉默HIF1α效果最好的siRNA5-8F和CNE2细胞分别转染3对siRNA(HIF1α-siRNA-1、HIF1α-siRNA-2和HIF1α-siRNA-3)、Negative-siRNA和转染间质Lipofactamine2000,常氧或缺氧培养48h,荧光定量PCR法检测HIF1α mRNA的相对表达量,实验重复3次,同时扩增P-actin作为内参。然后筛选出能有效抑制HIF1α表达的siRNA序列。2.4HIF1α-siRNA沉默HIF1α后对HIF1α及hTERT基因表达的影响5-8F和CNE2细胞转染HIF1α-siRNA和Negative-siRNA,常氧或缺氧培养48h,采用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测HIF1α和hTERT基因mRNA及蛋白的相对表达量,实验重复3次。3. HIF1α-siRNA抑制HIF1α对鼻咽癌细胞增殖、转移及耐药性的影响3.1鼻咽癌细胞周期检测实验分4组：未处理组(常氧)、未处理组(缺氧)、HIF1α-siRNA组(缺氧)和Negative-siRNA组(缺氧)。CNE2和5-8F细胞各以2～2.5×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中,按实验分组转染,转染后常氧培养12h,再继续常氧或缺氧持续培养36h后。收集细胞并用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,并调整细胞浓度为1×106/mL,加入预冷的70%乙醇,4℃固定过夜,洗涤离心后加入100μLRnase A和400μL PI,37℃避光染色30min,流式细胞仪行上述细胞周期检测。实验重复2次,每批细胞设2个样品。3.2Transwell小室实验检测鼻咽癌细胞的迁移能力5-8F和CNE2细胞各以2～2.5×105个/孔的密度接种于6孔板,按实验分组转染(实验分组同上),转染后常氧培养12h,再继续常氧或缺氧持续培养36h后。收集细胞并用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,并调整细胞浓度为1×106个/mL,加入预冷的70%乙醇,4℃固定过夜,洗涤离心后加入100μL Rnase A和400μL PI,37℃避光染色30min,流式细胞仪行上述细胞周期检测。实验重复3次。3.3MTT法测定siRNA沉默后对DDP及5-Fu化疗药物疗效的增敏情况取对数生长期的5-8F和CNE2细胞配成单细胞悬液,以1×104个／孔接种于96孔板中,200μL/孔；细胞培养24h后转染siRNA(实验分组同上),转染后12h每组各加入相应浓度的DDP (0、5、10、15、25、75、100μg/mL)和5-FU (0、10、25、50、75、100、150μg/mL),分别设置5个复孔,常氧或缺氧培养36h后,加入MTT溶液(5mg/mL)20μL/孔,继续培养4h后终止培养,小心弃掉孔内的培养上清液,每孔加入150μL的DMSO后避光振荡10min,在酶联免疫检测仪上测定波长为570nm处各孔的吸光度(OD)值。应用SPSS13.0统计软件计算DDP和5-Fu对细胞的IC50。实验重复3次。4.统计方法采用SPSS13.0统计软件处理结果,数据以均数±标准差(x±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05差异有统计学意义。结果1.缺氧处理后鼻咽癌细胞HIFlα及]hTERT的表达情况鼻咽癌5-8F和CNE2细胞缺氧培养(1%O2)0h-72h,采用免疫印迹检测缺氧培养对HIFlα和hTERT基因表达的影响。结果显示,常氧条件下CNE2和5-8F细胞既有一定水平HIFlα和hTERT的表达,随着缺氧处理时间的延长,5-8F细胞HIF1α和hTERT蛋白表达水分别在16、24h达到峰值,CNE2细胞HIFlα和hTERT蛋白表达水平在24h达到峰值,以后随着缺氧处理时间的延长,两种鼻咽癌细胞中HIF1α和hTERT蛋白表达均逐渐降低。说明缺氧可以上调鼻咽癌细胞株CNE2和5-8F的HIF1α和hTERT蛋白表达。2.鼻咽癌细胞siRNA的转染效率采用Lipofactamine2000瞬时转染化疗合成的Negative-siRNA-Cy3,转染后12h(6至24h内)荧光显微镜下肉眼观察被转染的细胞发红色荧光,流式细胞仪检测5-8F和CNE2细胞转染率分别为(98.8334±1.070)%、(98.367±0.586)%。3. HIF1α-siRNA特异性抑制HIF1α和hTERT基因表达的情况将siRNA(HIF1α-siRNA-1、HIF1α-siRNA-2和HIF1α-siRNA-3)及Negative-siRNA瞬时转染到鼻咽癌5-8F和CNE2细胞,荧光定量PCR检测各组HIF1α mRNA的相对水平。结果显示,在5-8F细胞,siRNA1-3组HIF1α mRNA表达水平与未处理组相比较差异均具有统计学意义(P<0.05),其中siRNA-1组与未处理组的差异最显著。在CNE2细胞,只有siRNA-1与未处理组的差异具有统计学意义。两种细胞均显示,Negative-siRNA组与未处理组差异无统计学意义,P>0.05。在两种细胞株均显示HIF1α-siRNA-1下调HIF1α mRNA的效果最明显,5-8F和CNE2细胞分别下调了0.703±0.021、0.813±0.012。因此,选择HIF1α-siRNA-1作为HIF1α特异性siRNA的。荧光定量PCR法及免疫印迹法检测HIF1α-siRNA对鼻咽癌细胞HIF1α和hTERT基因表达的影响。结果显示,缺氧情况下抑制HIF1α后,两组细胞HIF1α和hTERT的表达均显著下调,在5-8F细胞中,HIF1α的mRNA和蛋白水平分别下调了0.710±0.020和0.583±0.065, hTERT的mRNA和蛋白水平分别下调了0.633±0.051和0.492±0.069；在CNE2细胞中,HIF1α的mRNA和蛋白水平分别下调了0.799±0.023和0.649±0.193,hTERT的mRNA和蛋白水平分别下调了0.677±0.067和0.746±0.089。两组细胞中HIF1α和hTERT的mRNA与蛋白水平下调相一致。4.缺氧及干扰HIF1α后对鼻咽癌细胞周期的影响为了探索缺氧对肿瘤细胞生物学活性的影响及化疗耐药的机制,我们采用流式细胞术检测缺氧对肿瘤细胞周期的作用及HIF1α-siRNA抑制HIF1α对该种肿瘤细胞周期的影响。结果显示,缺氧诱导CNE2细胞G1/S阻滞,而5-8F细胞没有显著的G1/S阻滞(即无明显G0/G1峰增加,S峰下降)。缺氧条件下,抑制HIF1α的表达后,鼻咽癌CNE2细胞G0/G1期的比例下降(P<0.05),部分GO和G1期的细胞重新进入细胞周期循环,G2/M期细胞增多(P<0.05)；而鼻咽癌5-8F细胞中,S期细胞分布减少(P<0.05),而G2/M期上升(P<0.05),GO/G1期无显著变化。两种细胞均显示,未处理组(缺氧)与Negative-siRNA缺氧组之间差异无统计学意义,P>0.05。5.沉默HIF1α显著降低鼻咽癌细胞的迁移能力缺氧明显促进5-8F和CNE2细胞的迁移(P<0.05)。缺氧情况下,沉默HIF1α,与未处理组和Negative-siRNA组比较,在两种细胞均显示,HIF1α-siRNA组的迁移能力显著下降(P<0.05)。Negative-siRNA组和未处理组间差异无统计学意义。6. HIF1α干扰后DDP及5-Fu对鼻咽癌细胞作用的化疗敏感性结果随着药物浓度的增加,5-Fu对鼻咽癌细胞的增殖抑制率逐渐增强,在缺氧情况下,鼻咽癌5-8F和CNE2细胞对5-Fu的化疗敏感性均明显降低,P<0.05,HIF1α被干扰后,5-Fu对鼻咽癌细胞的IC50值明显低于未处理组和Negative-siRNA组,P<0.05,未处理组和Negative-siRNA组的ICso值差异无统计学意义,P>0.05。另外,缺氧处理5-8F和CNE2细胞对DDP的化疗敏感性也降低(P<0.05),抑制HIF1α后,显著上调了鼻咽癌细胞对DDP的化疗敏感性(P<0.05)。结论缺氧可能通过上调hTERT促进鼻咽癌细胞的恶性进展及肿瘤耐药,干扰HIF1α后,可以明显抑制hTERT表达并提高常用化疗药物的作用效果。提示缺氧对鼻咽癌生物学的影响可能是通过端粒酶活性变化来实现的。本研究为鼻咽癌靶向基因治疗提供了新的思路。