抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖过程中大量使用已导致相关抗生素耐药性的出现和广泛流行。硫酸多粘菌素在2016年之前一直被当作饲料添加剂在不同地区的养殖场中广泛使用,同时在生产多粘菌素的过程中会形成一些富含多粘菌素的残渣,这使得多粘菌素已经对水源和土壤等生态环境造成了极为严重的负面影响。多粘菌素类抗生素的长期应用必然导致细菌对多粘菌素耐药性的出现。2015年,我国学者首次发现了质粒介导的多粘菌素耐药机制MCR-1。从发现至今,已有超过70个国家和地区相继报道了不同来源携带mcr-1及其突变体病原菌,MCR-1介导的多粘菌素耐药性呈现全球性广泛流行。在MCR-1未出现之前,多粘菌素类抗生素和替加环素被认为是治疗碳青霉烯类抗生素耐药菌感染的“最后一道防线”。为此,我国农业农村部于2016年7月发布公告,决定从2017年4月起停止硫酸粘菌素用于动物促生长,同时欧洲药品管理局于2016年7月调高了多粘菌素使用所导致的耐药传播的风险级别。MCR-1本质上属于磷酸乙醇胺转移酶,其通过转移磷酸乙醇胺改变细菌膜电负性导致对多粘菌素的敏感性降低。MCR-1介导细菌对多粘菌素的耐药性属于低水平耐药（最小抑菌浓度值,Minimum Inhibitory Concentration,MIC≥8μg/m L为耐药）,最小抑菌浓度值均在8-64μg/m L之间,逆转细菌对抗生素的低水平耐药相对于高水平耐药而言较为简单可行。因此,这使得针对MCR-1及其突变体为靶标开展抑制剂研究迫在眉睫,也具有较好的可行性。本研究首先通过改良棋盘法最小抑菌浓度检测试验从200多种天然化合物中初步筛选获得了以广藿香酮为代表的潜在天然化合物MCR-1抑制剂,其与多粘菌素类抗生素联用具有协同抑菌效果,即广藿香酮显著增强多粘菌素对MCR-1阳性病原菌的体外抑菌作用。对广藿香酮相关化合物进行检测未发现协同抑菌作用显著优于广藿香的化合物。进一步地,通过生长曲线检测试验、杀菌曲线检测试验、活死细菌染色试验、扫描电镜检测和纸片法药敏检测等试验确定了广藿香酮在对受试菌株的生长无显著影响浓度条件下,可增强多粘菌素对MCR-1阳性菌的体外杀菌作用,即在9 h内可将培养基中的细菌完全杀灭,使细菌形态结构的完整性受到破坏最终死亡。由此,本研究初步确定了广藿香酮与多粘菌素具有体外协同杀菌作用。分子生物学技术结合计算机技术取得了显著的成果,这使得一些复杂难解决的问题都变得简单可行。本研究应用分子动力学方法对广藿香酮抑制MCR-1的潜在结合方式进行确证。首先,使用本实验室制备的鼠源MCR-1多克隆抗体通过蛋白免疫印迹检测了广藿香酮对MCR-1表达的影响,结果显示广藿香酮在有效浓度范围内不影响MCR-1的表达。通过分子动力学方法对广藿香酮与MCR-1或其突变体MCR-3的潜在结合位点进行对接和模型,结果显示广藿香酮结合至MCR-1或MCR-3活性中心附近,与靶蛋白通过氢键和范德华力等分子间作用力相互结合从而抑制其转移磷酸乙醇胺转移酶的活性。进一步地,以氨基酸定点突变大肠杆菌E.coli BL21（DE3）（p ET28a-mcr-1）为目标菌株,通过棋盘法最小抑菌浓度检测和Zeta电位检测确定了分子动力学模拟的准确性。本研究进一步通过细胞毒性试验和细胞感染试验在细胞水平对广藿香酮协同多粘菌素的作用进行了验证。细胞毒性结果显示,广藿香酮浓度在低于256μg/m L时对Hela细胞、J774细胞、A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞均无显著的细胞毒性。内化试验和黏附试验结果表明广藿香酮联合多粘菌素后内化到Hela细胞中沙门氏菌S.typhimurium HYM2的数量和黏附至A549细胞表面的大肠杆菌E.coli BL21（DE3）（p ET28a-mcr-1）的数量在3 h和6 h均显著地减少。结果说明广藿香酮可增强多粘菌素对由细菌介导损伤细胞的保护作用。为确定广藿香酮联合多粘菌素的体内协同效果,本研究建立了小鼠大肠杆菌腹腔感染模型,通过小鼠存活率、腹腔主要靶器官菌落定殖和靶器官病理变化等指标评价广藿香酮与多粘菌素的体内协同效果。与对照组相比,单独广藿香酮和粘菌素治疗后,小鼠的存活率均有所提高,联合低剂量治疗组与单独广藿香酮或粘菌素相比小鼠存活率显著提高。而联合高剂量治疗组与单独广藿香酮或粘菌素相比小鼠存活率提高不显著。此外,单独广藿香酮对MCR-1阳性大肠杆菌感染小鼠具有一定的治疗效果,这提示广藿香酮在针对MCR-1阳性大肠杆菌感染过程还具有其他药理学作用。综上所述,广藿香酮作为潜在MCR-1抑制剂可显著增强多粘菌素对不同MCR-1阳性病原菌的体内外抗菌活性。本项目为基于抑制细菌耐药性为靶标的抗感染策略新药研究提供了前期研究基础和先导化合物,同时也拓展了广藿香酮的药理学作用。