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乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤,2015年美国癌症协会(ACS)的年度统计数据报告显示,妇女乳腺癌的新增病例仍居首位,而乳腺癌的死亡率居女性癌症相关死亡的第二位。由于肿瘤细胞利用葡萄糖提供维持其增殖必需的营养源,因此高血糖为乳腺癌细胞的存活和生长提供了绝佳的环境。体内的高糖环境是促使肿瘤细胞增殖、分化和迁移的重要因素,高血糖或糖尿病可增加乳腺癌的发病风险和死亡风险。高血糖或糖尿病合并乳腺癌已经严重威胁人类健康,给经济社会和家庭带来了沉重的经济和精神压力。因此阐明高血糖或糖尿病与乳腺癌发生发展的关系、机制和治疗靶点,寻求一种相对安全有效的治疗方式,对于控制高血糖或糖尿病合并乳腺癌的发展具有非常重要的临床意义。近年来,传统中药在肿瘤中的应用已经成为了研究的热点。汉黄芩素是传统中草药黄芩的有效成分之一,属于黄酮类化合物,已有诸多文献报道黄酮具有多种药理作用,包括抗氧化,抗炎,抗病毒,抗肿瘤和抗过敏活性。诸多体外实验研究证实了汉黄芩素的抗肿瘤活性,包括其对骨髓性白血病细胞,原发性肝癌细胞,乳腺癌细胞,鼠肉瘤细胞,肺癌细胞,前列腺癌细胞和膀胱癌细胞的抑制作用；而对外周血单个核细胞和成纤维细胞并没有诱导细胞凋亡的作用。目前国内外文献中对汉黄芩素抑制乳腺癌的作用机制报道不一,且汉黄芩素对高糖诱导的乳腺癌细胞的抑制作用未有报道。结合已有的国内外文献中的研究报道和本研究前期实验结果,我们在体外模拟高糖环境,比较乳腺癌细胞在正常糖浓度和高糖浓度下的生长情况,观察汉黄芩素对不同环境下乳腺癌细胞的抑制作用,合理假设汉黄芩素可通过MAPKs信号通路,激活某一种或多种MAPKs亚型,从而抑制高糖诱导的人乳腺癌细胞的增殖,侵袭及转移。本研究主要包括以下两个部分：第一部分高浓度葡萄糖对人乳腺癌MCF-7细胞的影响作用目的：研究高浓度葡萄糖对人乳腺癌MCF-7细胞生存力,迁移及侵袭的影响,并探究其可能的作用机制。方法：采用MTT法检测不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的相对活力；运用Transwell法检测不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的侵袭能力；采用细胞划痕实验观察不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的迁移情况；采用TUNEL和DAPI双染法观察并分析不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的凋亡情况；运用蛋白免疫印迹(Western-blotting)技术检测不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞中AKT, PKCδ,及MAPKs各亚型总蛋白和磷酸化蛋白的表达情况；应用医学专用统计学软件对上述数据进行统计学分析。结果：(1)与正常浓度(5.5mM)葡萄糖组相比,MTT法测得的高浓度(11mM, 22mM)葡萄糖组MCF-7相对细胞活力明显升高,且暴露于葡萄糖时间越长,存活的细胞数增加越明显,两者差异有统计学意义p<0.05,0.01)。(2)与正常浓度(5.5mM)葡萄糖组相比,Transwell法测得的高浓度(11mM,22mM)葡萄糖组穿过基底膜侵入下室的MCF-7细胞明显增加,两者差异有统计学意义,(p<0.05,0.011。(3)与正常浓度(5.5mM)葡萄糖组相比,划痕实验观察到高浓度(11mM, 22mM)葡萄糖组划痕处MCF-7细胞覆盖率增加,两者差异有统计学意义,(p<0.05,0.011。(4)与正常浓度(5.5mM)葡萄糖组相比,高浓度(11mM,22mM)葡萄糖组TUNEL法显示红色荧光的MCF-7细胞数减少,DAPI法显示的蓝色荧光的细胞数增加,两者差异有统计学意义,p<0.05,0.01)。(5)与正常浓度(5.5mM)葡萄糖组相比,Western-blotting检测的高浓度(11mM,22mM)葡萄糖组AKT和PKC5的磷酸化水平明显增加,两者差异有统计学意义,p<0.05)。而P38MAPK的磷酸化水平降低,两者差异有统计学意义,p<0.05)。结论：(1)高浓度葡萄糖可提高人乳腺癌MCF-7细胞生存活力,促进侵袭和迁移,抑制凋亡。(2)高浓度葡萄糖可通过激活AKT和PKCΠ磷酸化,抑制P38MAPK磷酸化而实现其促肿瘤生长与进展的作用。第二部分汉黄芩素对高糖诱导的MCF-7细胞生长的抑制作用及机制研究目的：研究汉黄芩素对高糖诱导的MCF-7细胞活力,侵袭和迁移的抑制及促凋亡作用,并对其作用机制进行深入探究。方法：采用MTT法检测汉黄芩素处理后不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的相对活力；运用Transwell法检测汉黄芩素处理后不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的侵袭能力；采用细胞划痕实验观察汉黄芩素处理后不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的迁移情况；采用TUNEL和DAPI双染法观察并分析汉黄芩素处理后不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞的凋亡情况；运用蛋白免疫印迹(Western-blotting)技术检测汉黄芩素处理后不同浓度葡萄糖环境下MCF-7细胞中AKT, PKCδ及MAPKs各亚型总蛋白和磷酸化蛋白的表达情况；为了进一步证明P38MAPK信号通路在汉黄芩素抑制肿瘤的作用,我们加入P38 MAPK抑制剂SB203580和P38shRNA瞬时转染沉默P38基因重复上述实验,并观察结果。应用医学专用统计学软件对上述数据进行统计学分析。结果：(1)与未经处理的细胞相比,MTT法检测的经汉黄芩素处理的高浓度葡萄糖(11mM,22mM)的细胞活力明显降低,且葡萄糖浓度越高,抑制作用越明显,两者差异有显著统计学意义(p<0.05,0.01)。(2)与未经处理的细胞相比,Transwell法检测到经汉黄芩素处理的高浓度葡萄糖(11mM,22mM)的培养基内侵入到小室内的细胞数明显减少,两者差异有统计学意义(p<0.05)。(3)与未经处理的细胞相比,划痕实验观察到加入汉黄芩素处理的高浓度葡萄糖(11mM,22mM)的培养基内,MCF-7细胞迁移数量明显减少,接近初始状态,两者差异有统计学意义(p<0.05)。(4)与未经处理的细胞相比,经汉黄芩素处理的高浓度(11mM,22mM)葡萄糖组TUNEL法显示红色荧光的MCF-7细胞数明显增加,DAPI法显示的蓝色荧光的细胞数明显减少,两者差异有显著统计学意义(p<0.01)。(5)与未经处理的细胞相比,Western-blotting检测到经汉黄芩素处理的高浓度(11mM,22mM)葡萄糖组AKT和PKCδ的磷酸化水平降低,而P38磷酸化水平升高,差异有统计学意义(p<0.05)。(6)加入P38 MAPK抑制剂后SB203580,高浓度葡萄糖(11mM和22mM)组P-P38与P38总蛋白比例显著下降,MCF-7细胞的相对活力增强,细胞迁移和侵袭增加,凋亡减少,差异有统计学意义(p<0.05,0.01)。(7)与对照组相比,P38shRNA培养基中高浓度葡萄糖(11mM和22mM)下P-P38与P38总蛋白比例显著下降,MCF-7细胞的相对活力增强,细胞迁移和侵袭增加,凋亡减少,差异有统计学意义(p<0.05,0.01)。结论：汉黄芩素可通过抑制AKT和PKCδ的磷酸化和激活P38MAPK磷酸化抑制高糖诱导的MCF-7细胞生存,迁移和侵袭,促进凋亡。