人类许多疾病是由某种蛋白质表达低于正常水平或者某种蛋白质突变导致蛋白失活所引起的,针对这类疾病,目前的治疗策略主要是通过补充适量相应的蛋白质或多肽达到缓解疾病症状[1][2]。比如人工合成胰岛素治疗糖尿病[3],能够快速的缓解糖尿病症状及促进糖尿病导致的并发症快速的恢复。相比传统化学药物,生物制剂(蛋白及多肽类)具有针对性强、活性高、副作用小等优点,在目前的人类疾病治疗中发挥了越来越重要作用。然而,目前应用的临床治疗的蛋白质及多肽类的生物制剂仍然较少,探究其主要原因有以下几点:(1)该类药物属于蛋白质或多肽类分子,运输和储存都需要低温、低湿等严苛条件,一旦环境发生改变很容易导致药物失活;(2)大部分蛋白质及多肽在人体内代谢速度快,半衰期短(一般是几分钟左右)[4],无法到达有效的血药浓度。虽然目前通过改变其氨基酸序列、加侧链、加用缓释剂[5]等方法来延长其半衰期,但是仍然存在许多问题:改变其序列结构,不仅费时费力,并且极有可能导致其活性的降低甚至消失,也无法达到延长其半衰期的目的。半衰期问题的限制了很多蛋白质及多肽应用于临床治疗疾病。所以我们现在亟需要解决生物药半衰期短的问题。(3)绝大部分生物制剂还只能通过静脉或者皮下注射,半衰期短导致了患者经常需要多次注射该类药物,造成了依从性的下降。而这些问题都直接限制了该类药物在临床疾病治疗中的使用。寻找一种能够克服这些缺点的手段一直以来都是蛋白多肽类生物制剂研究的热点。人体寄生虫是与人类协同进化而来的,为了适应了人体内的环境,寄生虫已经发展了多种免疫逃避和抑制机制,从而得以在宿主体内存活,而且有些寄生虫还可能处于长期感染状态。随着基因修饰技术的迅速发展,目前已经可以对单细胞的寄生原虫进行成功的基因修饰,通过敲除某些原虫发育阶段的关键基因使其减毒,减缓其在人体内的生长速度,甚至可以达到条件性控制原虫在体内的增殖。另外,原虫在宿主体内寄生的过程中,会主动分泌多种蛋白抗原及多肽类物质进入宿主血液中[6]。相对于原核的细菌,原虫作为真核生物能够正确的翻译、折叠人源性蛋白质及多肽;这些都提示我们原虫具备与宿主长期共存、能够准确表达人源蛋白及毒性小等优点,对其进行转基因改造能够使其成为宿主内稳定表达生物制剂的工具,从而克服现有生物制剂运输困难、半衰期短及多次给药等缺点,有望成为一种新的生物治疗手段。本研究拟尝试利用原虫中研究较多的疟原虫和弓形虫为载体,通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定表达鼠源瘦素(Leptin)蛋白的减毒约氏疟原虫,验证其能否表达鼠源Leptin蛋白,并探讨其感染小鼠后,对小鼠体重的影响;同时,构建稳定表达人黑色素瘤抗原gp100蛋白的尿嘧啶缺陷型RH株弓形虫,为今后探讨其能否诱导小鼠产生gp100抗原特异性的抗肿瘤免疫反应奠定基础。一、感染瘦素蛋白转基因约氏疟原虫显著降低小鼠体重1.成功构建含Leptin基因的疟原虫:通过在p YC框架质粒(for plasmid for P.yoelii CRISPR/Cas9)中插入sg RNA序列,以及装入带Leptin基因的同源臂,然后将质粒电转进入疟原虫体内,通过乙胺嘧啶抗性筛选出带有p YC重组质粒的阳性疟原虫,再通过限制性稀释法成功筛选出转基因成功的单克隆的疟原虫。2.转基因疟原虫能表达Leptin:通过提取疟原虫的c DNA,然后通过扩增得到MIF-Leptin基因,送上海英俊公司测序,测序结果显示MIF与Leptin基因融合转录;然后用mouse Leptin抗体对疟原虫进行间接免疫荧光染色,结果发现转基因疟原虫能表达瘦素蛋白。3.感染转基因疟原虫显著降低小鼠体重:分别通过腹腔注射转基因疟原虫、野生型疟原虫感染C57小鼠,对照组注射等量PBS溶液,随后隔天检测其原虫血症及体重并记录;最后统计学分析原虫血症与体重的关系,结果显示原虫血症在一定范围内,转基因疟原虫能够降低C57/BL6小鼠体重,而野生型疟原虫不能。二、成功构建表达黑色素瘤抗原gp100的转基因减毒弓形虫1.成功构建弓形虫CRISPR-Cas9质粒和同源臂质粒:通过高保真酶对框架质粒(p SAG1-Cas9-U6-sg UPRT)进行扩增,然后环化,将sg RNA序列装入框架质粒中;通过重叠PCR的方法构建同源臂并插入重组质粒中。2.成功筛选和克隆表达gp100的转基因减毒弓形虫:将上述构建好的质粒电转进入弓形虫体内,然后通过乙胺嘧啶抗性筛选出电转成功的弓形虫。本研究主要尝试以人体寄生虫中的疟原虫弱毒株和减毒弓形虫作为载体表达和分泌宿主蛋白质。通过了CRISPR/Cas9基因编辑技术将小鼠瘦素基因插入疟原虫基因组中,经检测能够转基因弱毒疟原虫能够转录和表达瘦素蛋白,其感染小鼠后并能够降低宿主小鼠的体重;另外,成功构建能将gp100基因转入弓形虫基因的CRISPR/Cas9质粒,然后将gp100基因插入到弓形虫基因组中,从而构建能表达gp100的减毒弓形虫,为后续探讨其能否诱导抗肿瘤特异性免疫奠定基础。本研究中,通过基因组编辑技术构建了减毒原虫作为载体表达宿主蛋白,为探索新的人体内重组蛋白表达工具提供新的思路和理论依据。