【摘 要】
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单细胞微藻莱茵衣藻Chlamydomonas reinhards i是目前研究最多的产氢微藻之一,其核基因组编码的两种氢化酶HydA1与HydA2,均能进入叶绿体并借助光合作用电子传递链可逆地催化质子产氢。目前相关的研究主要集中在HydA1,因其酶活显著高于HydA2,在光照条件下,约75%氢气都是由HydA1催化而得。衣藻氢化酶作为结构最简单的氢化酶,其活性中心（称为氢簇）由通过肽链上的半胱氨酸
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单细胞微藻莱茵衣藻Chlamydomonas reinhards i是目前研究最多的产氢微藻之一,其核基因组编码的两种氢化酶HydA1与HydA2,均能进入叶绿体并借助光合作用电子传递链可逆地催化质子产氢。目前相关的研究主要集中在HydA1,因其酶活显著高于HydA2,在光照条件下,约75%氢气都是由HydA1催化而得。衣藻氢化酶作为结构最简单的氢化酶,其活性中心（称为氢簇）由通过肽链上的半胱氨酸残基相连接的经典的[4Fe4S]簇与特异性的[2Fe2S]亚簇组成。体外实验证实,氢簇的形成首先借助胞内的保守管家FeS合成机制合成[4Fe4S],然后通过特异性的成熟酶HydE、HydF与HydG体系合成并组装上[2Fe2S]亚簇。衣藻内主要有三种管家机制可以合成[4Fe4S],分别为线粒体中的ISC、细胞质中的CIA以及叶绿体中的SUF。HydE、HydF与HydG同样由核基因组编码,随后进入叶绿体中。为了探究氢化酶HydA1在衣藻细胞内的成熟过程,本课题将HydA1基因（全长cDNA TPplus-cydA1与不含信号肽的TPminus-chydA1,原始全长基因TPplus-ghydA1与不含信号妝的TPminus-ghydA1）导入一株氢化酶缺陷型突变莱茵衣藻核基因组中。然而无法成功表达氢化酶HydA1的cDNA,具体原因仍需进一步探究。本课题成功构建了在氢化酶缺陷型hydA1-1hydA2-1中表达同源氢化酶HydA1基因组序列ghydA1的体系,建立了抗生素初筛,克隆PCR,酶活初筛,氢化酶纯化,western-blot,体外[2Fe2S]成熟化以及[4Fe4S]重构的方法。本课题共筛选出四种不同表达型的莱茵衣藻转化株,分别为Hsp70A/rbcs2-TPplus-ghydA1-aph7（简称为 Hsp+）、Hsp70A/rbcs2-TPminus-ghydA1-aph7（简称为Hsp-）、HydA1 promoter-TPplus-ghydA1-aph7（简称为 HA+）、HydA1 promoter-TPminus-ghydA1-aph7（简称为HA-）。转化株Hsp+1与Hsp+2的体外氢化酶酶活甚至表现出高于野生型,分别高出34.3%和68.5%,具有进一步优化表达和工业化应用的潜力。经典的硫胁迫诱导与无氧胁迫诱导后的两种转化株中,都能纯化得到高活性的酶蛋白。不含信号肽的转化株HA-1,HA-2,Hsp-以及Hsp-2的胞内氢化酶活性极低,并且诱导后纯化得到的氢化酶同样活性极低,体外添加模拟[2Fe2S]的化学合成[2Fe]MIM能够在一定程度上提高酶活;当在体外进行[4Fe4S]重构再添加[2Fe]MM后酶活得到大幅度的显著提高。结果表明,未能进入叶绿体中的氢化酶蛋白被滞留在细胞质中,无法合成FeS簇,因此莱茵衣藻氢化酶HydA1的氢簇在进入叶绿体之前无法合成及组装。利用相同的表达体系,在氢化酶缺陷型c中成功表达了 5 ’端融合了 HydA1信号肽的绿色荧光蛋白GFP,胞内荧光成像结果显示,相对于未融合信号肽的荧光蛋白的荧光集中于细胞质中,融合了信号肽的绿色荧光集中在叶绿体中,进一步证实了 HydA1信号肽能够引导融合表达蛋白进入衣藻叶绿体中。以上结果再结合本课题平行课题“在莱茵衣藻叶绿体中同源表达氢化酶HydA1”的结果,即HydA1经过密码子优化后的cDNA序列可以成功在叶绿体中被表达,且具有活性,由此可以得出最终结论,莱茵衣藻氢化酶HydA1的[4Fe4S]以及[2Fe2S]均是在叶绿体中合成并组装的。
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