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目的:利用生物信息学的方法和技术原理,对细粒棘球绦虫不同发育阶段基因的表达谱进行差异比较和生物学功能分析,找出细粒棘球绦虫原头蚴阶段特有的抗原分子,为筛选包虫病特异性诊断抗原奠定基础。方法:1.细粒棘球绦虫不同发育阶段表达谱的差异分析:对国家人类基因组研究中心(CHGCS)公开发表在http://chgc.sh.cn/Eg的细粒棘球绦虫m RNA测序数据进行差异分析,根据数据库中测得的细粒棘球绦虫不同发育阶段的reads饱和度和RPKM表达丰度,筛选出在六钩蚴阶段不表达而在原头蚴阶段高表达的基因。2.使用uniprot和Softberry Prediction软件对这些基因进行亚细胞学定位,筛选出表达膜蛋白或者胞外分泌蛋白的基因。应用DNA Star、NCBI/BLAST公共数据库和www.Predictprotein.org在线数据库对这些编码膜蛋白或胞外分泌蛋白的基因进行二级结构分析、抗原表位预测和同源性比较分析,进一步缩小范围,找出适合做诊断抗原的分子。3.选择其中的一个分子进行重组表达载体的构建与表达(1)根据所获取的目的片段的序列设计引物,TRIZOL法提取人源细粒棘球绦虫原头蚴的总RNA,采用RT-PCR扩增目的基因;(2)将目基因克隆到p GEM-T载体,转化入大肠杆菌JM109中;(3)将目的基因克隆到p ET-28a表达载体中并转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达重组蛋白,经含Ni2+的His-bind树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。4.重组蛋白的免疫学特性分析(1)利用重组蛋白免疫动物,获得抗血清;(2)用r EG-01883免疫小鼠得到抗血清,通过ELISA和Western-blot的方法,对该重组蛋白的免疫学特性进行分析与鉴定。5.初步评估该分子对的潜在诊断价值:使用该重组蛋白包被ELISA板,分别使用包虫病人和正常人的血清予以识别,对该重组蛋白的潜在诊断价值进行判断与评估。结果:1.通过差异筛选,从7218个六钩蚴中不表达而原头蚴表达的分子中获得319个原头蚴阶段特异性高表达基因。2.生物信息学方法最终确定了26个编码膜蛋白或胞外分泌蛋白的基因。3.选择其中的一个分子EG-01883成功构建基因工程菌株EG-01883/p ET-28a/BL21(DE3),表达并纯化出分子量约36k D的蛋白。4.ELISA结果显示显示:?用纯化的重组蛋白r EG-01883免疫小鼠,可以诱导产生特异性Ig G抗体;?免疫后血清细胞因子IFN-γ和IL-4的变化水平均较佐剂组与对照组显著升高,差异均具有统计学意义(p<0.05),表明该蛋白可刺激小鼠产生强烈免疫应答;?Western blot结果显示,该重组抗原可被His-Tag标签抗体、重组蛋白免疫小鼠血清以及本室保存继发感染血清识别,而不被空白组小鼠血清识别。5.重组蛋白r EG-01883能被包虫病人血清特异性识别,且与正常人血清相比具有显著性差异,(p<0.05)。结论:重组蛋白EG-01883具有较好的免疫原性和抗原性,能识别包虫病人血清,有成为临床诊断抗原的潜在价值。