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豚鼠由于在发育、生理和免疫反应机制等方面与人类存在诸多的相似而成为一种用于研究发育生物学和疾病的发病机制与致病机理的理想动物模型。豚鼠对多种呼吸道病原体高度敏感,如豚鼠很容易感染结核分枝杆菌,且感染后产生酷似人类的进行性肺结核病变,这使得豚鼠成为结核分枝杆菌分离、鉴别、诊断和各种抗结核病药物和疫苗的筛选,以及致病机理研究的理想动物模型之一。然而,相对其它实验动物而言,由于缺乏有效的免疫学试剂及豚鼠肺脏细胞生物学的相关参考资料,极大限制了利用豚鼠动物模型开展肺脏疾病的研究工作。因此,系统研究豚鼠呼吸道上皮细胞形态组成学及主要先天免疫调控信号通路,TLR信号在豚鼠肺脏中的表达定位,将有助于进一步揭示豚鼠肺脏上皮的生物学特征,为研究豚鼠的肺脏先天免疫机制及其作为呼吸道疾病模型的致病机理提供理论基础。为此,我们开展了相关的研究工作,并取得以下结果:
1.本项目通过电镜、组织化学染色(HE、PAS等)、免疫组织化学(IHC)染色等方法对豚鼠呼吸道主要上皮细胞的类型组成(基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞、克拉拉细胞、神经内分泌细胞)进行形态学和微细结构等细胞生物学特征的观察。结果显示,豚鼠肺脏上皮细胞的组成类型与特征比小鼠和人的肺脏存在更多的相似性,这表明其比小鼠更适合于人肺脏疾病动物模型。另外,研究发现抗人、小鼠和/或兔源的Keratin14、Keratin18、CGRP、CCSP和Mucin5AC抗体均与豚鼠发生交叉反应,为进一步利用这些免疫学试剂探讨豚鼠肺脏上皮细胞在先天免疫中的作用机理奠定了基础。
2.提取新鲜豚鼠肺组织的RNA,反转录为cDNA作为模板,通过反转录PCR的方法扩增、克隆并鉴定了豚鼠肺脏组织中TLRs信号通路中的相关信号分子TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR10、MYD88和TRAF6等9种TLR信号通路因子的基因片段,并利用RT-PCR的方法检测到它们在肺脏中均有表达;免疫组化结果显示TLR4/2、TLR3、TLR6、TLR11、MYD88和TRAF6为染色阳性,表明这6种作用于其它品种的抗体可用于豚鼠相关信号蛋白表达的免疫组化鉴定。Realtime-qPCR的检测结果发现,在普通级实验动物不同个体间的TLR2、TLR4、TLR7和TLR10存在表达水平的差异,且下游信号分子MYD88和TRAF6总体表达水平较高。根据免疫组化和Realtime-qPCR试验结果,对相对表达量较高的MYD88和TLR11与肺脏上皮细胞的特异表达蛋白进行免疫荧光双染,准确定位了它们在豚鼠肺脏上皮细胞中的克拉拉细胞、基底细胞和肺泡Ⅱ型细胞中均有表达,在纤毛细胞中不表达。
以上试验结果为阐释TLR样受体信号通路在豚鼠肺脏先天免疫机制中的分子机理奠定了基础,从而为进一步利用豚鼠研究先天免疫机制提供了理论依据。