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背景:人类VPS13蛋白家族包括四个成员,分别命名为VPS13A、VPS13B、VPS13C、VPS13D。研究报道发现VPS13A/C是脂质转运蛋白,VPS13A位于内质网（endoplasmic reticulum,ER）-线粒体/脂滴（lipid droplets,LDs）的膜接触位点（membrane contact sites,MCSs）上,VPS13C则位于ER-晚期内吞体/LDs的MCSs上,而VPS13B则与高尔基体（Golgi apparatus,Golgi）有关,负责维持Golgi完整性。每个VPS13蛋白功能缺失突变均导致特定的常染色体隐形遗传性疾病,因此VPS13蛋白极具研究价值,是领域内的研究热点。其中,VPS13D功能缺失突变导致一种常染色体隐性遗传病-痉挛性共济失调（ataxia with spasticity）,同时伴有线粒体形态异常、能量产生减少及脂质沉积。但是,目前对于VPS13D的细胞定位及其细胞生物学功能研究尚属空白。目的:探究哺乳动物VPS13D的细胞定位以及细胞生物学功能。方法:我们首先构建了带有超折叠绿色荧光蛋白标签（superfolder GFP,sf GFP）的表达载体VPS13D^sf GFP,在HEK293细胞中表达该载体,确定VPS13D^sf GFP的细胞定位。另一方面,用免疫荧光（IF）方法确定内源性VPS13D蛋白的定位。另外,我们构建了VPS13D截断突变体,旨在解析VPS13D定位的分子机制以及其结构域的功能。我们利用激光共聚焦显微镜以及高分辨率Airyscan显微镜（LSM900,LSM）和配置有超分辨率模块的Leica SP8,观察了VPS13D全长及所有截断突变体在完全培养基（complete medium,CM）和葡萄糖饥饿状态下的定位。同时,我们通过密度梯度离心方法进一步证实了VPS13D截断突变体DUF1162和VPS13D＿N在细胞内的定位。我们还利用Heli Quest工具,鉴定出VPS13＿C结构域中的两个两性螺旋结构,并且对其做点突变以确定这两个两性螺旋对于VPS13＿C定位到LDs是否为必需结构。通过GFP-Trap分析了VPS13D及其截断突变体与其他蛋白如TSG101的相互作用。利用荧光分子重组技术构建ER-线粒体和线粒体-LDs的MCSs定量报告系统。我们利用RNAi干扰技术敲降VPS13D,观察其对线粒体-LDs MCSs、ER-线粒体MCSs以及对线粒体功能的影响。VCP/P97抑制剂NMS873药物处理细胞观察对ER-线粒体MCSs的影响。结果:在CM条件下,哺乳动物细胞中VPS13D主要以弥散的形式定位在胞质,其中相当一部分定位到线粒体外膜上,而少量定位于LDs。而当使用不含葡萄糖、只含油酸的Earle’s平衡盐溶液（OA/EBSS）培养细胞之后,VPS13D在线粒体-LDs接触位点处富集。在CM条件下,VPS13D蛋白C端的截断突变体t VPS13D-5与LDs共定位,用OA处理增强其招募至LDs的程度。位于t VPS13D-5上的VPS13＿C结构域（氨基酸残基3981-4339）靶向LDs。另外,我们研究提示VPS13D是通过VPS13＿C上的两个两性螺旋结构与LDs结合的。在CM条件下,少量VPS13D＿N定位在线粒体上,而OA刺激条件下则增强了其被招募至线粒体外膜（outer mitochondrial membrane,OMM）的程度。我们发现DUF1162结构域与内吞体分选转运必需复合体（endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）蛋白TSG101存在相互作用,并且VPS13D-TSG101之间的相互作用对于TSG101招募至LDs上是必不可少的。我们的研究进一步提示VPS13D在维系线粒体-LDs间的MCSs中起到重要作用。我们发现VPS13D敲降显著增强了ER-线粒体的相互作用。同时,我们确认VPS13D敲降对ER和其他细胞器包括Golgi体、过氧化物酶体、早期内吞体以及晚期内吞体/溶酶体间的相互作用没有影响。我们的结果表明VPS13D在线粒体DNA（mitochondrial DNA,mt DNA）的合成以及线粒体Ca2+摄取中发挥关键作用。VPS13D敲降后,正在复制的mt DNA密度减少,并且体积显著增大。VPS13D敲降导致离子霉素（ionomycin）诱导的线粒体Ca2+摄取过程异常。我们的研究提示VPS13D与ER-线粒体系链蛋白VAPB和PTPIP51,以及AAA-ATPase VCP/P97均有相互作用。VPS13D敲降导致VAPB在ER-线粒体MCSs处大量富集。抑制VAPB-PTPIP51后能够挽救VPS13D抑制所导致的ER-线粒体高度耦合现象。VCP/97变构抑制剂NMS873处理细胞后,观察到ER-线粒体呈现高度耦合,与VPS13D敲降所导致的表型一致。结论:我们的研究结果提示,VPS13D是与线粒体、LDs密切相关的蛋白,并且在葡萄糖饥饿状态下富集于线粒体-LDs的MCSs上。VPS13D负责维系线粒体-LDs MCSs的稳定,抑制VPS13D导致线粒体-LDs MCSs减少。并且,抑制VPS13D还导致ER和线粒体高度耦合,引起线粒体功能障碍。VPS13D与VCP/P97协同作用调控VAPB表达,从而负性调控ER与线粒体的相互作用。