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背景和目的各种慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)常伴随不同程度的肾脏炎症。疾病早期,炎症发挥保护作用,但持续的炎症状态最终促进肾损伤,进而造成病理上的肾脏纤维化及临床上的终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)。在细胞水平,炎细胞的招募及活化是核心。在浸润的多种炎症细胞中,巨噬细胞在调节肾脏炎症及纤维化中发挥重要作用。临床研究提示,CKD患者中,肾脏巨噬细胞浸润越多,预后越差。循环中的单核细胞在炎症信号的驱使下进入肾脏,经历不同途径分化为经典激活的M1型巨噬细胞或选择激活的M2型巨噬细胞。在持续损伤作用下,M1型巨噬细胞促进炎症,最终导致肾脏纤维化;M2型巨噬细胞发挥抗炎作用,最终修复肾脏损伤。环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)经细胞色素 P450(cytochrome P-450,CYP450)的代谢产物,在体内发挥舒张血管、促进血管再生、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及利钠等重要的生理学功能。EETs在可溶性表氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)作用下,降解为失活的脱氢二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)。因此,sEH是决定EETs生物学活性的关键分子。基因敲除或药理学阻断sEH,增加组织或血浆中EETs水平,可增加其生物学效应。研究提示,无论利用基因手段还是药理学干预sEH,增加EETs,均可发挥降压及抗炎作用,能够在糖尿病肾病、高血压肾病及单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)肾脏纤维化动物模型中预防纤维化的进展。sEH在肾间质炎细胞浸润的机制及途径尚不清楚。肾小管上皮细胞高表达sEH是否对巨噬细胞浸润及极化发挥作用,尚未见报道。在中国,IgA肾病是CKD最常见的病理类型,除了肾小球病变外,多表现为不同程度的肾小管间质炎细胞浸润。本研究将利用IgA肾病肾穿刺组织,分析sEH表达与临床及病理指标的相关性;通过体外细胞实验观察蛋白尿刺激及调控sEH表达对巨噬细胞极化的影响,探讨肾小管上皮细胞sEH表达与巨噬细胞极化的关系及其机制,为sEH抑制剂治疗肾脏慢性炎症状态及延缓纤维化进展提供干预的新靶点。研究共分两个部分:第一部分:IgA肾病肾小管sEH表达与临床及病理指标的相关性研究利用IgA肾病肾穿刺组织,进行sEH免疫组化染色,分析肾组织sEH表达与临床及病理指标的相关性;探讨肾小管上皮细胞sEH表达与巨噬细胞浸润及炎症因子分泌的相关性,为进一步探讨sEH与巨噬细胞浸润及极化作用提供临床证据。第二部分:肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的机制研究观察蛋白尿及调控sEH表达对肾小管上皮细胞分泌诱导巨噬细胞极化炎症因子表达的影响;用不同条件干预sEH活性的肾小管上皮细胞培养基孵育巨噬细胞,观察巨噬细胞极化的标志物及细胞转导通路关键蛋白的变化,探讨肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的作用及可能机制。第一部分IgA肾病肾小管sEH表达与临床及病理指标的相关性研究一、材料与方法收集我院肾内科经肾穿刺诊断为IgA肾病的肾穿刺组织标本、冰冻切片、尿液及临床病理资料共71例。冰冻切片进行sEH免疫组化染色,根据肾小管sEH染色阳性部位面积分为+～++++四组。1.收集临床数据:年龄、性别、平均动脉压、24小时尿蛋白定量及估算的肾小球滤过率(estimating glomerular filtration rate,eGFR);2.病理学数据:系膜细胞增殖、毛细血管内细胞增生、节段性肾小球硬化、肾小管萎缩/间质纤维化、肾小管间质炎细胞浸润;3.肾组织标本进行Western blot检测sEH蛋白质水平表达;4.利用ELISA试剂盒检测尿液14,15-EET/14,15-DHET评估肾组织sEH活性;5.冰冻切片进行sEH及CD68免疫荧光双染色;6.肾组织标本进行Realtime-PCR检测MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA水平表达。二、结果1.IgA肾病组肾组织sEH表达及活性明显增加。应用免疫组化染色半定量及Western blot结果提示,与正常对照组相比,IgA肾病组肾小管sEH蛋白质表达明显增加(P<0.05)。随着sEH在肾小管表达的增加,14,15-EET/14,15-DHET减小,sEH活性增加(P<0.05)。2.在sEH表达程度不同的IgA肾病组四组间,平均动脉压、蛋白尿、肾间质炎细胞浸润差异具有统计学意义(P<0.05)。随着sEH表达增加,平均动脉压、蛋白尿及肾间质炎细胞浸润程度逐渐加重。3.肾小管sEH表达与平均动脉压(r=0.408)、蛋白尿(r=0.452)、肾间质炎细胞浸润(r=0.247)呈正相关(均P<0.05)。4.免疫荧光染色结果提示sEH阳性的肾小管周围存在较多CD68阳性的巨噬细胞。5.Realtime-PCR结果提示sEH低表达IgA肾病组肾组织MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNA明显高于正常对照组(P<0.05),sEH高表达IgA肾病组上述指标明显高于sEH低表达IgA肾病组(P<0.05)。三、结论在IgA肾病肾组织中,肾小管sEH表达及活性明显增加;肾小管sEH表达与平均动脉压、24小时尿蛋白定量及肾间质炎细胞浸润有关;肾小管sEH表达可能促进巨噬细胞极化细胞因子表达,参与巨噬细胞浸润及极化。第二部分肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的机制研究一、材料与方法以人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)及小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)为研究对象。应用蛋白尿、sEH抑制剂+蛋白尿、EET+蛋白尿及sEH过表达腺病毒处理HK-2细胞。用上述不同条件处理的HK-2细胞培养基,孵育RAW264.7细胞系,IFN-y及IL-4作为诱导M1型及M2型巨噬细胞的阳性对照。Western blot检测 sEH、p65、p-p65、Akt、p-Akt 蛋白表达,Realtime-PCR 检测 MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-α、iNOS、Arg-1、IL-10mRNA 表达。二、结果1.与正常对照组相比,尿蛋白组HK-2细胞sEH蛋白质水平及MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA水平表达明显增加(均P<0.05)。与蛋白尿组相比,sEH抑制剂尿蛋白组上述炎症因子明显减少(均P<0.05),sEH蛋白质表达无明显变化。2.与蛋白尿组相比,EET尿蛋白组MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNAshu水平明显减少(均P<0.05),但sEH蛋白质表达无明显变化。3.与正常对照组及GFP腺病毒组相比,sEH过表达腺病毒组HK-2细胞sEH蛋白质水平及MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNA水平均明显增加(P<0.05)。4.与正常对照组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比,尿蛋白、sEH过表达腺病毒HK-2培养基处理的巨噬细胞及正常对照HK-2培养基外源性加入IFN-γ组巨噬细胞IL-6、iNOSmRNA表达明显升高(P<0.05);与蛋白尿组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比,sEH抑制剂+蛋白尿组、尿蛋白HK-2培养基外源性加入EET组及正常对照HK-2培养基外源性加入IL-4组巨噬细胞Arg-1、IL-10 mRNA水平明显增加(P<0.05)。5.与正常对照组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比,尿蛋白、sEH过表达腺病毒HK-2培养基处理的巨噬细胞及正常对照HK-2培养基外源性加入IFN-γ组巨噬细胞p-p65蛋白表达明显升高(P<0.05);与蛋白尿组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比,sEH抑制剂+蛋白尿组及尿蛋白HK-2培养基外源性加入EET组明显抑制蛋白尿对p-p65上调,促进p-Akt表达(P<0.05)。三、结论上调肾小管上皮细胞sEH,促进诱导M1型巨噬细胞极化的细胞因子表达;肾小管上皮细胞sEH通过细胞因子及EETs的旁分泌作用,激活NF-κB-p65途径促进巨噬细胞向M1型极化,抑制PI3K-Akt途径抑制M2型巨噬细胞极化。抑制sEH后可逆转上述作用。