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白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)是IL-12家族的重要成员,是一种典型的异源二聚体细胞因子,由其特有的p19亚基和与IL-12共用的p40亚基组成。哺乳动物中的研究表明,IL-23通过促进Th17细胞分泌IL-17A及IL-22等细胞因子稳定其表型,并介导炎症的产生以及自身免疫疾病的发生,因此被认为是一种重要的促炎症细胞因子。目前,已有几种硬骨鱼的p19及p40亚基被分离克隆,其中发现不同于哺乳动物,鱼类IL-23的p40亚基存在多个拷贝,因此推测鱼类IL-23可能存在多种异构体。但是,鱼类IL-23存在异构体的假设还缺乏直接证据,而且IL-23在硬骨鱼中的功能地位未明,包括鱼类IL-23在炎症反应中的地位、是否类似哺乳动物同系物促进Th17相关细胞因子的表达等。本论文以草鱼为研究模型,证明了草鱼中存在三种IL-23异构体,比较分析了它们在感染条件下的表达特征,重组表达并鉴定了这些IL-23分子的生物学活性,重点探究草鱼IL-23介导Th17相关细胞因子的表达及相关机制。另外,基于IL-23调节草鱼免疫细胞自噬的发现探讨了自噬在鱼类炎症调控中的作用。具体内容如下:1、炎症条件下草鱼IL-23的诱导表达特征分析。(1)体内实验的结果显示嗜水气单胞菌的感染能引起草鱼IL-23的p19及p40a,p40b亚基的转录水平在免疫组织中不同程度的上调,而p40c的表达水平没有明显变化。(2)体外实验结果表明经典的促炎症细胞因子IL-1β能诱导IL-23各亚基表达的上调。这些结果提示IL-23可能参与了草鱼的炎症反应。2、草鱼IL-23存在三种异构体的证据及重组蛋白的制备。(1)在HEK293细胞中同时过表达草鱼IL-23的p19及p40亚基,利用免疫共沉淀(Co-IP)方法证明了草鱼的p19亚基能分别与p40a,p40b及p40c形成异源二聚体分子,表明草鱼中存在三种形式的IL-23蛋白分子。(2)构建串联p19与p40亚基的IL-23真核表达质粒,利用CHO(dhfr-)细胞表达系统重组表达并纯化获得草鱼的三种IL-23异构体蛋白。3、草鱼IL-23异构体的免疫功能研究。(1)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测结果显示草鱼的三种IL-23异构体蛋白均能引起头肾白细胞(HKLs)中Th17相关细胞因子表达的上调,如IL-17A/F1,IL-22及IL-26等。(2)RT-qPCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测到三种IL-23异构体蛋白能上调IL-1β的基因表达和蛋白分泌水平。(3)RT-qPCR结果表明IL-23异构体与IL-1β能协同上调Th17相关细胞因子的表达,进一步证明IL-23在草鱼炎症反应中起重要的作用。4、草鱼IL-23异构体调控Th17相关细胞因子表达的信号通路分析。(1)蛋白质免疫印迹杂交(WB)实验结果揭示三种IL-23异构体均能诱导STAT3,ERK及JNK的磷酸化从而激活STAT3和MAPK信号通路。(2)STAT3,ERK及JNK的抑制剂能阻碍IL-23对Th17相关细胞因子表达的诱导作用,表明IL-23异构体可能通过STAT3及MAPK信号通路调控这些细胞因子的表达。5、草鱼IL-23调节草鱼免疫细胞自噬及自噬在鱼类炎症调控中的作用的初步探究。(1)证明了草鱼细胞自噬的发生。从草鱼头肾中克隆得到自噬的标志分子LC3B,其序列与哺乳动物同系物序列的高度一致性提示了自噬功能的保守性。进一步,采用稳定转染GFP-LC3B的草鱼肾细胞(CIK),共聚焦显微镜图像显示LPS或饥饿能诱导自噬的发生,同时,GFP-LC3B的稳转细胞株在LPS或者饥饿刺激时比对照组细胞呈现更强的增殖能力,证明了草鱼细胞中发生的自噬现象。(2)草鱼IL-23三种异构体均能上调HKLs的自噬水平,表明IL-23可能通过调节细胞自噬参与草鱼免疫调控。(3)为验证上述假设,开展自噬参与草鱼炎症反应调控的探究。体内实验结果表明嗜水气单胞菌的刺激显著诱导草鱼头肾等组织中LC3B的基因表达。体外实验结果证明在草鱼CIK或者HKLs中,自噬阻断剂3-MA能增加CIK和HKLs中IL-1β及TNF-α的基因表达和蛋白分泌。这些结果说明草鱼自噬参与了炎症反应的调控。综上所述,本论文在揭示草鱼的一个p19基因和三个p40基因的诱导表达特征基础上,首次证明鱼类IL-23存在三种异构体,它们的重组蛋白对Th17相关细胞因子表达的调节作用及其机制证明了鱼类IL-23的功能保守性。此外,草鱼IL-23异构体诱导草鱼细胞自噬的作用提示其参与炎症反应调控的新途径,特别是自噬参与炎症因子表达分泌的发现强化了IL-23异构体在鱼类炎症反应的地位。