迟钝爱德华菌是鳗鲡的主要病原菌,为了解发病过程中迟钝爱德华菌和鳗鲡的相互作用机制,本试验对迟钝爱德华菌EIB202侵染后鳗鲡肝细胞的蛋白质组进行了差异分析并对该菌侵染相关的基因PuAH的部分功能进行了研究。一方面,构建迟钝爱德华菌的体外侵染模型,追踪观察细胞病变并由此确定侵染的关键时间点,提取不同侵染时间点的细胞蛋白并利用差异蛋白组技术(iTRAQ)进行分析,找出差异蛋白,对差异蛋白进行KO、GO注释和聚类分析;另一方面,利用原核表达技术对迟钝爱德华菌EIB202侵染相关基因PuAH进行克隆表达,纯化融合蛋白并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验、黏附试验分析所得融合蛋白的特性。所获结果如下:不同侵染时期鳗鲡肝细胞差异蛋白组试验结果:试验成功构建了迟钝爱德华菌EIB202对鳗鲡肝细胞的侵染模型,不同侵染关键时间点细胞存在特征性病变:2 h时细胞开始萎缩,细胞间隙变大;4h时细胞开始变圆,肿胀,细胞核明显,几乎呈半贴壁状态;6 h时部分细胞已凋亡,瓶底出现空白区域。itraq数据分析后,共找到12个差异蛋白,其中2h有4个,均为上调蛋白;4h有5个,亦均为上调蛋白;6 h有8个,7个为上调蛋白,1个为下调蛋白。经KO、GO注释和聚类分析发现这些蛋白分别和能量代谢、生物合成、蛋白质分选降解、脂质运输及细胞凋亡调控等相关,且功能相似的蛋白在不同侵染时期的变化趋势基本相同。迟钝爱德华菌EIB202侵染相关基因PuAH功能验证试验结果:SDS-PAGE结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于菌体裂解上清中,融合蛋白分子量约为42 ku;ELISA和Western bloting试验证明了融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性;在凝集试验中,兔抗血清对EIB202菌体有良好的凝集效果;在溶血和溶血抑制试验中,融合蛋白对鳗鲡红细胞不具溶血性,但兔抗血清对EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用;在黏附功能分析试验中,融合蛋白无黏附阻断效果,且兔抗血清对菌体的的黏附也无明显的抑制作用。综上所述,本试验阐述了迟钝爱德华菌EIB202侵染后鳗鲡肝细胞蛋白的差异变化,并且验证了迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因可能和凝集、溶血相关,为迟钝爱德华菌致病机制的深入研究提供了参考数据。