本研究首次探讨人卵巢组织冷冻对生殖细胞印记基因IGF-2／H19是否有影响，比较慢速程序化和固相表面玻璃化冷冻对卵巢组织中原始和初级卵泡IGF-2／H19基因CpG岛的甲基化状态及两基因在卵泡中表达的影响。 本研究分三部分： 1.探讨固相表面玻璃化技术和其它载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果，并在优选载体的基础上，比较不同浓度冷冻保护剂对卵巢组织中卵泡形态的影响及玻璃化冷冻效果； 2.比较固相表面玻璃化冷冻和传统程序化冷冻对人卵巢组织冻存的效果； 3.比较固相表面玻璃化冷冻和程序化冷冻对印记基因IGF-2／H19差异甲基化区(DMR)关键CpG岛甲基化程度及两基因在原始卵泡和初级卵泡表达的影响。 第一章　玻璃化冷冻方案对人卵巢组织冻存的研究 　　目的：探讨固相表面玻璃化冷冻和其它载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果，并优选的玻璃化载体基础上，比较不同浓度冷冻保护剂对卵巢组织的毒性和冷冻效果，优选出适合人卵巢皮质的玻璃化冷冻方案。 方法 1、标本预处理和分组手术中取得16例卵巢组织，及时切割成5mmx1mmx1mm的皮质小条，随机分到不同处理组：新鲜组(F组)和不同玻璃化组，包括冷冻管玻璃化组(TV组)、最小微滴玻璃化组(MDS组)、不锈钢网筛玻璃化组(SLV组)和固相表面玻璃化组(SSV组)。 2、玻璃化冷冻和复温采用20％DMSO+20％EG溶液作玻璃化冷冻液，梯度渗透卵巢皮质，采用不同载体系统行玻璃化快速冷冻并于液氮保存。复温时，将组织置于37℃ 1 M蔗糖溶液中快速解冻后，经梯度蔗糖浓度逐步洗脱冷冻保护剂。 3、体外培养和检测指标①各组冻融后的卵巢皮质一部分用于体外培养，每隔一天检测培养液中雌二醇和孕酮的浓度； ②新鲜组、其余冻融后皮质以及培养后组织经4％多聚甲醛固定后，制备HE切片，用于组织学观察卵泡形态，盲法计数形态正常及异常的卵泡。 4、不同浓度冷冻液对卵巢组织毒性和用于固相表面玻璃化效果的比较 结论: 1、玻璃化冷冻可以保存卵巢组织中大部分原始卵泡和初级卵泡的正常形态，并能较好的保存其体外生长和性激素分泌功能； 2、将固相表面玻璃化冷冻技术用于人卵巢组织冷冻，与冷冻管、最小微滴法、不锈钢网筛相比，首次证明使用的半悬于液氮中的铝箔做载体的SSV技术更适合人卵巢组织的玻璃化冷冻； 3、与15％DMSO+15％EG相比，采用20％DMSO+20％EG为冷冻液并结合SSV技术是一适合人卵巢组织冷冻的有效玻璃化方案。 第二章人卵巢组织固相表面玻璃化冷冻和程序化冷冻的比较研究 　　目的：比较固相表面玻璃化冷冻和传统程序化冷冻对人卵巢组织冻存的效果。 方法: 1、标本预处理和分组临床取得26例卵巢组织，切割成5mm×1mm×1mm皮质小条，随机分到不同处理组：新鲜组(F组)、固相表面玻璃化组(SSV组)和程序化冷冻组(SF组)。 2、卵巢组织冷冻和复苏 ①固相表面玻璃化冷冻：采用第一章优化的SSV冷冻方案； ②程序化冷冻：采用被广泛认可的Gosden程序化冷冻方案。 3、体外培养和检测指标 结论: 固相表面玻璃化冷冻和程序化冷冻都能较好的保存人卵巢组织中绝大部分原始和初级卵泡的正常形态以及解冻后体外培养时的生长能力和性激素分泌功能，两者对人卵巢组织的冻存效果相当。 第三章　人卵巢组织固相表面玻璃化和程序化冷冻对印记基因IGF-2/H19甲基化程度及其在卵泡表达的影响 　　目的：探讨固相表面玻璃化冷冻和程序化冷冻对印记基因IGF-2／H19差异甲基化区(DMR)关键CpG岛甲基化程度及两基因在原始卵泡和初级卵泡表达的影响。 方法: 1、卵巢组织的预处理和分组同第二章 2、固相表面玻璃化冷冻和程序化冷冻的过程同第二章 3、检测指标 结论: 1、未检测到固相表面玻璃化冷冻和程序化冷冻对印记基因IGF-2／H19 DMR关键CpG位点甲基化程度有影响； 2、未发现两种冷冻方法对原始和初级卵泡中IGF-2蛋白和H19 RNA的表达有影响； 3、未发现人卵巢组织冷冻对生殖细胞印记基因IGF-2／H19有不利影响的证据。