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下肢深静脉血栓形成(Deep Venous Thrombosis,DVT)是常见的外周血管疾病,可引起血栓后综合征(Post-thrombotic syndrome,PTS)和致死性肺动脉栓塞(Pulmonary embolism,PE)。目前深静脉血栓治疗方法包括药物抗凝溶栓、手术取栓和导管溶栓,但都未能消除血栓后综合征发生、远期通畅率不高、易于复发等缺点,因此需要一种更加安全有效的方法治疗深静脉血栓。在缺血性疾病中,干细胞研究取得了积极进展,其中内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)近年来研究较多,内皮祖细胞是来源于骨髓中的血管内皮前体细胞,在新生血管形成过程中起着重要作用。我们前期研究结果发现,在大鼠静脉血栓模型中,移植的大鼠EPCs可归巢到静脉血栓中,改善血栓微环境,促进急性血栓的溶解和慢性血栓的机化再通。但EPCs应用面临很多问题,移植的EPCs仅少量可分化为血管内皮细胞,如何改善EPCs功能,成为缺血性疾病重要的研究方向。MicroRNAs(miRNAs,miR)是一类长度约22nt的非编码RNA,miRNAs通过完全匹配或者不完全匹配的方式识别靶基因3’-UTR区域,抑制蛋白翻译或者影响mRNA稳定性,在转录后水平调控蛋白表达,发挥重要的生物学功能。近年研究证实miRNAs参与EPCs功能调节,在血管新生和血管生成中扮演重要角色。但miRNAs在深静脉血栓患者和正常患者外周血EPCs中表达有无差异,这些差异性的miRNAs能否调控EPCs功能和影响静脉血栓溶解再通,带着这些问题,设计了本课题。我们采集DVT患者和健康人外周血样本,通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,体外诱导培养EPCs,利用基因芯片筛选DVT患者和健康人EPCs中miRNAs的表达谱差异,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证芯片结果,对和芯片结果一致的miRNAs,通过文献检索和生物信息学分析挑选认为值得深入研究的miRNAs做细胞功能实验(我们挑选了6个miRNAs),观察这些miRNAs对EPCs的迁移、成血管和凋亡等细胞功能是否有影响,细胞功能结果显示miR-483-3p对EPCs功能有影响,我们对miR-483-3p做更深入研究,通过生物信息学预测miR-483-3p可能的靶基因,通过荧光素酶报告基因实验、上调和下调miR-483-3p、共转染和基因沉默后用Western blot检测蛋白变化进一步确认靶基因,以及共转染和基因沉默后对EPCs功能的影响。体内实验通过建立大鼠血栓模型,共聚焦荧光显微镜、HE染色和DSA观察mi R-483-3p调控EPCs后对EPCs归巢和血栓溶解再通的影响。结果发现:miR-483-3p在DVT患者EPCs中高表达;下调EPCs中mi R-483-3p表达会促进EPCs迁移、成血管能力,抑制EPCs凋亡,促进EPCs归巢和EPCs对血栓的溶解再通。我们的研究为干细胞治疗静脉血栓探索新的思路。本实验研究,将分为5部分,主要研究方法及结果如下。第一部分人外周血内皮祖细胞和大鼠骨髓源性内皮祖细胞的培养和鉴定目的:建立人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)和大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定方法,为后续体外和体内实验奠定基础。方法:采用密度梯度离心法分离人外周血和大鼠骨髓单个核细胞,将单个核细胞悬于含20%胎牛血清(FBS)EGM-2培养基中,培养2~3周,显微镜下观察细胞形态特征,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD34、CD133、VEGFR-2表达量,双荧光染色检测细胞摄取DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1能力。结果:刚分离的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)和骨髓单个核细胞(Bone marrow-derived mononuclear cells,BMMNC)圆形体积小,2天后可见少数细胞贴壁,3天后细胞体积逐渐变大,贴壁细胞增多,5天后部分细胞呈纺锤形生长,出现细胞集落,四周细胞呈放射样排列,第10至14天,细胞呈现铺路石或鹅卵石样改变。流式细胞仪显示细胞表面主要表达内皮标记物VEGFR-2,CD34、CD133表达低。双荧光染色显示细胞能够吞噬DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1。结论:在EGM-2培养基诱导下,成功的从人外周血单个核细胞和大鼠骨髓单个核细胞中培养出EPCs,2~3周培养后呈现晚期EPCs特征。第二部分下肢深静脉血栓患者EPCs中mi RNAs差异表达谱筛选及验证目的:利用基因芯片筛选DVT患者和健康人外周血EPCs中mi RNAs的表达谱差异,并用q RT-PCR验证芯片结果的可靠性。方法:采集DVT患者和健康人外周血样本,利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞进行EPCs培养,通过mi RNA基因芯片筛选DVT患者和健康人EPCs的mi RNAs表达谱差异,并用q RT-PCR验证芯片结果。结果:Mi RNA基因芯片显示mi R-483-3p等多个mi RNAs在DVT患者和健康人外周血EPCs中表达存在差异,q RT-PCR结果和芯片一致。结论:Mi R-483-3p等多个mi RNAs在DVT患者和健康人外周血EPCs中表达有差异。第三部分Mi R-483-3p对内皮祖细胞功能的影响及靶基因预测和验证目的:探讨mi R-483-3p对人外周血EPCs迁移、成血管能力和凋亡的影响,预测其靶基因并验证。方法:用Lipofectamine 3000将mi R-483-3p模拟物(agomir)、抑制物(antagomir)和阴性对照物转染到EPCs中,用transwell实验检测mi R-483-3p对EPCs迁移的影响,用matrigel管腔形成实验检测mi R-483-3p对EPCs成血管能力的影响,用流式细胞仪检测mi R-483-3p对EPCs凋亡的影响。利用生物信息学预测mi R-483-3p可能的靶基因,利用荧光素酶报告基因实验、q RT-PCR和western blots等实验确认靶基因。结果:上调EPCs中mi R-483-3p表达会抑制EPCs迁移和成血管能力,促进EPCs凋亡,下调EPCs中mi R-483-3p表达结果和上调相反,生物信息学预测血清反应因子(serum response factor,SRF)可能是靶基因,q RT-PCR和western blots等实验验证SRF就是mi R-483-3p的靶基因。结论:上调EPCs中mi R-483-3p表达会抑制EPCs迁移和成血管能力,促进EPCs凋亡;SRF是mi R-483-3p靶基因。第四部分Mi R-483-3p慢病毒载体的构建和表达目的:构建mi R-483-3p/mi R-483-3p sponge慢病毒表达载体,感染大鼠EPCs,并验证EPCs中mi R-483-3p表达情况,为后续体内实验奠定基础。方法:将mi R-483-3p前体序列和慢病毒载体经酶切连接产生p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p和p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p sponge,与辅助包装载体一起转染293T细胞,收集病毒上清感染EPCs,用荧光显微镜观察转染效率,用q RT-PCR检测感染后EPCs内mi R-483-3p表达情况。结果:慢病毒载体p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p/p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p sponge构建成功,转染EPCs后能有效上调和下调EPCs内的mi R-483-3p表达。结论:成功构建了携带目的基因mi R-483-3p的慢病毒载体p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p/p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p sponge。第五部分Mi RNA-483-3p调控内皮祖细胞对静脉血栓溶解再通的影响目的:研究mi R-483-3p调控大鼠EPCs后对EPCs归巢和EPCs对静脉血栓溶解再通的影响。方法:将慢病毒载体p GLV3-H1-GFP vector、p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p和p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p sponge转染至EPCs中,采用结扎左肾静脉下方的下腔静脉构建大鼠深静脉血栓模型,再将转染的EPCs通过大鼠尾静脉移植到血栓模型中。分四组:A组(10只),空白对照组,经尾静脉注入1 ml PBS;B组(10只),EPCs/p GLV3-H1-GFP vector(EPCs/vector组),经尾静脉注入1 ml含有1.0×106EPCs/vector的PBS细胞悬液;C组(10只),EPCs/p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p(EPCs/mi R-483-3p组),经尾静脉注入1 ml含有1.0×106 EPCs/mi R-483-3p的PBS细胞悬液;D组(10只),EPCs/p GLV3-H1-GFP-mi R-483-3p sponge(EPCs/mi R-483-3p sponge组),经尾静脉注入1 ml含有1.0×106EPCs/mi R-483-3p sponge的PBS细胞悬液。术后7天收集标本,经荧光显微镜观察EPCs在血栓中的归巢,经HE染色、数字减影血管造影(digital subtract angiography,DSA)观察静脉血栓溶解再通情况。结果:经GFP荧光标记的EPCs出现在静脉血栓中,不同实验组的阳性细胞数比较:EPCs/mi R-483-3p sponge组>EPCs/vector组>EPCs/mi R-483-3p组,提示mi R-483-3p抑制EPCs归巢至静脉血栓中。各实验组血栓重量比较:blank control组>EPCs/mi R-483-3p组>EPCs/vector组>EPCs/mi R-483-3p sponge组,提示mi R-483-3p抑制EPCs的溶栓能力。HE染色观察各实验组血栓溶解再通情况比较:EPCs/mi R-483-3p sponge组>EPCs/vector组>EPCs/mi R-483-3p组>blank control组;DSA观察各实验组血栓溶解再通情况比较:EPCs/mi R-483-3p sponge组>EPCs/vector组>EPCs/mi R-483-3p组>blank control组;提示过表达mi R-483-3p会抑制EPCs对静脉血栓的溶解再通,下调mi R-483-3p能促进EPCs的溶栓能力。结论:移植转染后的EPCs能够归巢至静脉血栓中,上调mi R-483-3p抑制了EPCs归巢能力和EPCs对静脉血栓的溶解再通,下调mi R-483-3p能促进EPCs归巢和溶栓能力。