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目的:(1)构建出稳定过表达LOXL2基因的胆管癌细胞系QBC939,以期进一步深入探索LOXL2蛋白的功能及作用机制。(2)在稳定细胞系QBC939-EX-LOXL2中转入SUMO-2/3干扰基因,观察沉默SUMO-2/3对QBC939细胞Snail蛋白表达量的影响。(3)在稳定细胞系QBC939-EX-LOXL2中转入过表达SENP1基因,观察过表达SENP1对QBC939细胞Snail蛋白表达量的影响。方法:(1)设计以G418为研究目的的剂量——反应分析实验,摸索G418对于QBC939细胞系的最低致死浓度。(2)通过脂质体转染的方法构建稳定过表达LOXL2基因的QBC939细胞系,利用实验得到的G418最低致死浓度筛选QBC939细胞以获取阳性克隆,扩增培养阳性细胞,并以普通QBC939细胞和QBC939-vector-LOXL2细胞作为对照组,运用荧光定量PCR实验和蛋白免疫印迹Western Blot技术检测LOXL2的mRNA的表达以及LOXL2的蛋白翻译情况,从而确保过表达LOXL2基因转染的QBC939细胞模型最终构建成功。(3)以稳定过表达LOXL2的QBC939细胞作为对照组,QBC939-EX-LOXL2+Control si RNA 细胞作为空载组,QBC939-EX-LOXL2+SUMO-2/3 siRNA作为实验组,运用蛋白免疫印迹Western Blot技术检测在干扰SUMO-2/3蛋白的影响下,Snail蛋白的表达变化量。(4)以稳定过表达LOXL2的QBC939细胞作为对照组,QBC939-EX-LOXL2+Vector-SENP1 1 胞作为空载组,QBC939-EX-LOXL2+EX-SENP1作为实验组,运用蛋白免疫印迹Western Blot技术检测在SENP1蛋白过表达的影响下,Snail蛋白的表达变化量。结果:(1)G418剂量-反应分析实验结果表明,浓度为600-1000ug/ml的G418将培养的QBC939细胞全部杀死,而600ug.ml以下均有细胞存活,故600ug/ml为G418筛选QBC939细胞的最低致死浓度。(2)600ug/ml的G418筛选转染过表达LOXL2基因的QBC939细胞7-11天后,可见阳性细胞的克隆,以普通QBC939细胞和Vector-LOXL2细胞作为对照组,运用荧光定量PCR实验检测LOXL2的mRNA的表达,蛋白免疫印迹Western Blot技术检测有LOXL2蛋白的翻译。(3)以稳定过表达LOXL2的QBC939细胞作为对照组,QBC939-EX-LOXL2+Control si RNA 细胞作为空载组,QBC939-EX-LOXL2+SUMO-2/3 siRNA作为实验组,运用蛋白免疫印迹Western Blot技术检测在干扰SUMO-2/3蛋白的影响下,Snail蛋白的表达量在实验组下降。(4)以稳定过表达LOXL2的QBC939细胞作为对照组,QBC939-EX-LOXL2+Vector-SENP1 1 胞作为空载组,QBC939-EX-LOXL2+EX-SENP1作为实验组,运用蛋白免疫印迹Western Blot技术检测在SENP1蛋白过表达的影响下,Snail蛋白的表达量下降。结论:(1)稳定过表达LOXL2基因的QBC939细胞系构建成功,为进一步探索LOXL2蛋白的功能及作用机制及其与胆管癌细胞侵袭转移的关系奠定了深厚的基础。(2)进一步证明LOXL2蛋白通过介导SUMOylation提高胆管癌细胞Snail蛋白的稳定性,为预防和治疗胆管癌细胞的侵袭和转移提供了新的靶点。