本文运用最新发展的慢病毒载体(Lentiviral vector)包装系统，构建携带HCV代表株H77(1a)、中国HeBei株(1b)以及JFH-1株(2a)丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒，将其分别与慢病毒包装质粒及携带有标记基因的转移质粒共转染293FT细胞，产生三种不同基因型的丙型肝炎包膜感染性假型(pseudotyped)病毒颗粒，并将此假病毒发展为一种丙肝病毒进入细胞的感染模型及体外中和抗体滴定方法，应用于评估丙型肝炎患者体内的中和抗体水平及不同HCV基因工程疫苗在小鼠体内的体液免疫效果的研究。主要依据结果如下： 一、丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备。利用PCR方法亚克隆HCV代表株H77(1a)、JFH-1(2a)以及中国HeBei株(1b)的E1-E2包膜糖蛋白基因(HeBei株基因3’端约300bp片段为人工合成)，分别插入pVRC载体构建pVRC-H77-E1E2、pVRC-JFH-E1E2、pVRC-HeBei-E1E2三种真核表达质粒(包膜质粒)。经间接免疫荧光法及Westem blot验证了其在细胞膜(293细胞)上的正确表达。三种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR′CMV△8.2及携带EGFP报告基因的转移质粒pCS-CG(Self-Inactivating，自灭活)共转染293FT细胞，制备HCV假病毒，western blot验证了E1/E2包膜糖蛋白在假病毒颗粒上的表达与掺入。从上清中获得的HCV假病毒可以在体外感染肝癌细胞系Huh7及Huh7-CD81(且后者上的感染效率约为前者上的2-3倍)，但无法感染非肝细胞293，也不能感染不表达CD81分子的肝源性细胞HepG2。利用p24ELISA法及感染性实验对HCV假病毒进行滴定，p24含量为5-25ng/ml，转导单位为10<4>-10<5>TU/ml。结果表明，成功包装了三种HCV包膜感染性假病毒颗粒。 二、基于HCV假病毒的体外中和实验方法的建立及应用。利用针对HCV E2蛋白的具有广谱交叉中和活性的单克隆抗体AP33对三种HCV假病毒进行微量中和实验，结果显示，mAb AP33能够在体外有效中和三株HCV假病毒，经细胞流式分析，其半数感染抑制(IC<,50>)的抗体稀释度范围为1∶250-1∶500。结果表明，成功建立了HCV包膜感染性假病毒体外中和实验方法。 为了进一步评价假病毒体外中和实验方法的有效性，同时进一步探讨HCV包膜糖蛋白基因免疫所诱发的针对同型及异型HCV假病毒的中和抗体水平，构建了表达}IeBei株结构基因的2种重组腺相关病毒rAAV1-E1E2、rAAV2-E1E2。间接免疫荧光法证实了rAAv-E1E2在细胞水平上均可以有效的表达目的蛋白。经单次肌肉注射免疫小鼠，六周时免疫荧光法检测小鼠血清中针对E1E2的总抗体，结果显示，rAAV1-E1E2、rAAV2-E1E2和空病毒对照组中针对E1E2的总抗体滴度为1∶80、1∶60、1∶5；应用HeBei株。HCV包膜感染性假病毒进行体外中和实验，结果显示，中和抗体滴度为1∶20、1∶10、ND。其中rAAv1-E1E2免疫血清的总抗体及抗HeBei株中和抗体略高于rAAV2-E1E2；各组免疫血清中均未检测到针对H77株及JFH-1株HCV包膜感染性假病毒的交叉中和抗体。 为了研究HCV感染者体内的中和抗体水平，收集了8份HCV慢性感染者血清样本(S1-S8)，经酶免疫试验(EIA)方法测定其抗HCV抗体滴度(s1：≥1∶1000、S2：≥1∶100、P3：≥1∶1000、S4：≥1∶1000、S5：≥1∶100、S6：≥1∶1000、S7：≥1∶1000、S8：≥1∶1000)。经假病毒体外中和实验测定，结果显示，8份血清样本中均能检测到针对HCV假病毒的中和抗体，滴度在1∶20-1∶320之间。不同的血清样本针对三种HCV假病毒的中和效价存在2-4倍的差异。 本研究的主要结果和发现可总结为： 1．基于具有自我灭活特性的慢病毒载体系统，成功包装了包括中国流行株在内的3种不同基因型的HCV包膜感染性假病毒颗粒； 2.建立了基于假病毒颗粒的HCV体外中和抗体检测方法。3．该检测方法可以用于HCV感染者体内及HCV基因工程疫苗免疫后中和抗体水平的分析。 本课题为研究HCV感染早期特性(如宿主嗜性、受体结合、膜融合等)及特异抗病毒药物(如病毒进入的抑制剂等)的体外筛选提供了有效模型，并为评价表达HCV不同包膜区基因片段的基因工程疫苗的体液免疫效果，进而发展有效的HCV疫苗及防治手段提供了技术支持。