论文部分内容阅读
研究背景:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一个重要的公共卫生问题,其发病机制目前尚未完全明了,主要与炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激以及自主神经系统功能紊乱(如胆碱能神经受体分布异常)有关。最近研究结果表明细胞凋亡可以导致肺泡壁的破坏,参与肺气肿的形成,在COPD发病机制中起重要作用。COPD病理损伤属于不可逆改变,临床上缺乏理想的治疗方法,因此需要寻找一种能够修复损伤组织的有效方法。近年来,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)成为干细胞研究的热点,它不仅具有分化功能还具有分泌功能,有研究提出骨髓MSCs可能对COPD具有修复作用。因此,本课题应用骨髓MSCs静脉注射到木瓜蛋白酶联合钴60处理所致的大鼠肺气肿模型中,探讨COPD形成的机制以及骨髓MSCs对COPD损伤组织修复作用的机制,为干细胞治疗COPD的可能提供实验依据。研究目的:1.观察体外分离培养大鼠骨髓MSCs的生物学性状。2.研究木瓜蛋白酶联合钴60处理所致的肺气肿大鼠肺泡壁细胞的凋亡情况。3.探讨大鼠骨髓MSCs干预在肺气肿大鼠的肺泡壁细胞凋亡和肺气肿发展过程中的作用。研究方法:1.原代培养:无菌取8周龄雄性大鼠骨髓,经密度梯度离心后取单个核细胞层接种,保留贴壁细胞传代,观察细胞生长情况。2.细胞分析:测定生长曲线,流式细胞仪测定MSCs表型和细胞周期分析;体外检测MSCs向成骨细胞、脂肪细胞的分化情况。3.动物分组:12周龄雌性大鼠随机分为4组,每组6只,分别为:正常对照组(A组),木瓜蛋白酶组(B组),木瓜蛋白酶和钴60处理组(C组),木瓜蛋白酶和钴60处理+骨髓MSCs干预组(D组)。动物造模:A组:气管内注入磷酸盐缓冲液(PBS)+尾静脉注射PBS;B组:气管内注入8%木瓜蛋白酶液+尾静脉注射PBS;C组:气管内注入8%木瓜蛋白酶液+钴60照射+尾静脉注射PBS;D组:气管内注入8%木瓜蛋白酶液+钴60照射+尾静脉注射雄性大鼠骨髓MSCs悬液。造模时间8周。4.检测指标:观察肺组织病理学变化;TUNEL法检测肺泡壁细胞的凋亡指数;免疫组化法检测肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞数;PCR检测位于Y染色体的Sry基因;ELISA方法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平;Western blot法检测肺组织VEGF和血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)蛋白表达。实验结果:1.培养的骨髓MSCs具有体外扩增潜能和多向分化潜能。2. B组、C组、D组大鼠均出现肺气肿改变,B组、C组、D组平均内衬间隔(MLI)、平均肺泡面积(MAA)和单位面积平均肺泡数(MAN)与A组比较有显著性差异(P<0.01)。D组与C组相比肺气肿样改变减轻,在这两组之间肺平均内衬间隔(MLI)、平均肺泡面积(MAA)、单位面积平均肺泡数(MAN)差异均有统计学意义(P<0.01)。3. B组、C组、D组大鼠肺泡壁细胞的细胞凋亡指数(AI)染色阳性的细胞百分比显著高于A组(P <0.05),而表面活性蛋白-C(SP-C)染色阳性的细胞百分比显著低于A组(P <0.05)。D组大鼠肺泡壁AI低于C组(P <0.05),而SP-C染色阳性的细胞百分比高于C组(P <0.05)。4. D组大鼠肺组织中可以扩增出与正常雄性大鼠一致的DNA片段序列。5. B组、C组、D组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中VEGF水平、肺组织中VEGF与VEGFR2水平显著低于A组(P <0.05)。D组BALF中VEGF水平明显高于C组,而且肺组织中VEGF与VEGFR2水平也明显高于C组(P <0.05)。结论:大鼠肺泡壁细胞特别是Ⅱ型肺泡上皮细胞的凋亡参与肺气肿的形成,肺组织VEGF水平表达减少可能是导致肺气肿大鼠肺泡壁细胞凋亡的原因之一。骨髓MSCs干预肺气肿大鼠,可能通过分化为肺泡壁细胞,逆转VEGF和VEGFR2表达减少来减轻肺泡壁细胞凋亡和肺气肿的发生。