猫弓首蛔虫ITS、cox1序列分析及LAMP方法的建立

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弓首蛔虫主要寄生于犬科和猫科动物,以猫弓首蛔虫和犬弓首蛔虫最为常见。猫弓首蛔虫是全世界分布普遍的寄生虫,也是常被忽略的蠕虫。人误食猫弓首蛔虫虫卵后,由于人类并非猫弓首蛔虫的适宜宿主,幼虫会在人体组织和器官移行但不能在小肠内发育为成虫。已有研究证明,当人感染猫弓首蛔虫后,会引起内脏幼虫移行症(VLM),眼睛幼虫移行症(OLM),嗜酸粒细胞性脑膜炎(EME)、隐性弓首蛔虫病和神经性病症等。因此,猫弓首蛔虫准确有效的种类鉴定和检测方法,对人类感染猫弓首蛔虫的预防和控制等研究具有重要的公共卫生意义。本研究第一部分是从购于广东省内不同地区的猫肠道采集寄生虫,通过形态学方法进行初步鉴定,后以PCR扩增和序列分析对虫体再次鉴定,结果显示:此次共检查了142只猫肠道,其中有102只猫感染肠道寄生虫,感染率为71.8%。根据形态学和分子生物学鉴定结果,发现有6种虫体分别为:孟氏迭宫绦虫、复孔绦虫、巨颈绦虫、华支睾吸虫、猫弓首蛔虫和管型钩虫;感染率分别为30.3%、21.1%、19.7%、3.5%、21.1%和4.9%,其中绦虫感染率最高,其次是猫弓首蛔虫、管型钩虫和华支睾吸虫,这些虫体大多为人畜共患寄生虫病,给人类健康造成很大的安全隐患。本研究第二部分是对采集到的26条猫弓首蛔虫的核糖体ITS序列和线粒体DNA的pcox1序列进行遗传变异分析,首先通过PCR扩增方法获得26条猫弓首蛔虫虫体样品的ITS(ITS1+5.8S r RNA+ITS2)序列,并提交到GenBank且获得登录号;对rDNA片段进行遗传变异分析,结果显示:ITS-1和ITS-2的长度分别是:462 bp和335 bp,基因片段的AT比分别是:48.1%48.9%和51.6%53.2%,这与过去的研究结果相符;与犬弓首蛔虫相比,发现ITS-1、ITS-2种内差异较小,种内序列差异分别为02.4%和02.7%,而种间差异显著,分别为10.7%15.9%和11.3%17.9%。PCR扩增和测序获得26条猫弓首蛔虫虫体样品的线粒DNA中细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因部分序列,提交到GenBank获得登录号;对pcox1片段进行突变情况分析,用ML方法进行系统发育关系构建。序列分析结果显示:pcox1长度为308 bp,基因片段的AT比是62.5%65.8%,这与Liu等过去的研究结果相符合;pcox1序列进行遗传变异分析,发现pcox1种内差异较小而种间差异显著,分别为03.6%和8.6%13.2%;系统发育关系的构建结果显示,本研究采集的猫弓首蛔虫样本与犬弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、犊弓首蛔虫为姊妹群关系。对ITS序列和cox1基因部分序列的分析表明,猫弓首蛔虫分离株的遗传变异性较低,但不同种序列差异较显著,可为物种间系统发育分析和寄生虫鉴定提供合适的遗传标记。本研究第三部分建立了猫弓首蛔虫LAMP检测方法,将获得的猫弓首蛔虫ITS序列和线粒体pcox1基因序列设计了10套引物,筛选出了一套特异性、敏感性最佳的引物T-5,并进行了温度优化、反应时间优化、特异性和敏感性测试。通过试验筛选出最佳反应温度为63°C,最佳反应时间为65min;特异性引物对狮弓蛔虫、孟氏迭宫绦虫、复孔绦虫、巨颈绦虫、华支睾吸虫、管型钩虫等进行扩增均为阴性,标明该引物有良好的特异性;可检测到的最小DNA浓度为10-5 ng/μL,与普通PCR相比敏感约103倍。用优化的LAMP检测法对来自广东省内82份流浪猫粪进行检测,发现19份为阳性,阳性率为23%,而常规镜检法仅发现13份有猫蛔虫卵。LAMP检测方法与PCR方法相比简便、快速、特异、敏感而且成本低,在猫弓首蛔虫病的诊断上有明显的优势。本研究对猫弓首蛔虫mt DNA和r DNA序列进行了遗传变异分析,并建立了猫弓首蛔虫LAMP快速检测方法,不仅丰富了猫弓首蛔虫核糖体和线粒体基因序列数据,而且为弓首蛔虫群体遗传学、分子分类学等研究及线虫病分子流行病学调查提供了数据和方法。
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