装载混合多肽的羟基磷酸锌/磷脂杂化纳米粒诱导抗黑色素瘤免疫效应的研究

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目的:为了实现不同亲疏水性多肽在同一纳米粒中的共装载和高包封以及树突状细胞对抗原的有效呈递并诱导T淋巴细胞免疫效应,对疏水性多肽进行磷酸化修饰,设计了磷脂包被羟基磷酸锌(LZnP)纳米载体。该纳米载体系统能够实现多种多肽和免疫佐剂MPLA的共输送,激活机体自身的免疫系统来产生特异性的抗肿瘤免疫应答,识别并杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤的生长和转移。  方法:以反相微乳法联合薄膜水化法制备羟基磷酸锌/磷脂杂化纳米粒。以透射电镜、扫描电镜、红外光谱、X射线衍射等表征纳米粒,以高效液相色谱检测多肽包封率,以激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对包载荧光标记多肽的纳米粒胞内摄取进行了分析,同时通过流式检测仪对树突状细胞(DCs)的体内外刺激熟化效应进行检测。用ELISA试剂盒对成熟DCs所分泌的细胞因子进行测定,ELISPOT检测免疫小鼠免疫器官IFN-γ的分泌,并通过建立黑色素瘤预防、治疗以及肺转移动物模型对其免疫学效果进行评价。  结果:合成了粒径在30nm左右,形貌规整,大小均一的ZnP纳米粒,该纳米颗粒对HGP100、P15E及磷酸化TRP2多肽的包封率分别达到77.7±2.5%、66.2±1.4%和61.7±1.5%。磷脂层包覆的ZnP纳米粒能够促进多肽更加高效的进入并滞留在DC2.4细胞中,与MPLA共同作用刺激原代DC的熟化及细胞因子的分泌。包载混合多肽的LZnP纳米粒与MPLA共同构建的癌症疫苗在肿瘤的预防、治疗和肺转移动物实验中取得了良好的效果。  结论:成功构建了一个抗原与佐剂共输送的LZnP纳米载体系统,该纳米载体系统充分利用了Zn2+与多肽的相互结合特性,实现多种抗原多肽的高效装载。同时LZnP纳米粒具有良好的生物相容性,能够促进靶细胞对纳米粒的吞噬,避免多肽被酶类的水解和突释,实现抗原有效持续的呈递。更重要的是,LZnP纳米粒呈现出了免疫佐剂效应,增强了DC的熟化,细胞因子的分泌从而增强机体的免疫应答效应。LZnP纳米粒的Zn2+的特殊螯合作用、免疫佐剂特性及其磷脂层的可靶向修饰性为其在癌症纳米疫苗制备方面提供了良好的应用前景。
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