1目的意义云南省位于我国西南边疆,大多数地区属热带和亚热带气候,自然条件复杂,适于媒介昆虫和虫媒病毒的分布和传播,以往调查证实云南省存在着近10种虫媒病毒及其相关性疾病的分布和流行。除广泛分布有流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)外,还存在其它虫媒病毒病的流行。云南边境地区常有病毒性脑炎和不明原因发热病人的发生和流行。由于许多病毒性脑炎和不明原因发热疾病与虫媒病毒感染有关,为掌握该地区虫媒病毒病流行状况,本课题在云南省部分地区采集病毒性脑炎和不明原因发热疾病的血清和脑脊液标本,进行相关虫媒病毒核酸检测以及病毒分离,并应用分子生物学技术对相关虫媒病毒阳性标本,进行基因序列的测定与分析和病毒基因型研究。通过调查研究,以掌握相关虫媒病毒病流行状况及流行病毒株的分子流行病学特点,为该地区疾病防治提供科学依据。2研究方法于2008年7月～9月在滇西、滇南的保山、德宏、大理和西双版纳边境地区开展调查,采集病毒性脑炎和不明原因发热病人血清和脑脊液标本,并进行病例个案调查,建立标本采集和试验检测数据库,对采集到的病人标本采用RT-PCR和实时荧光PCR法进行虫媒病毒核酸检测,用C6/36细胞培养和乳鼠接种方法对上述标本进行了病毒分离。采用Clastal×1.83进行核苷酸序列比对,采用DNAstar中MegAlin软件进行核苷酸序列、氨基酸序列同源性分析。并采用MEG4软件依次进行乙脑PrM-C区段、登革病毒PrM-C、NS5区段基因核苷酸序列系统发生树分析。3研究结果在上述4州市共采集到病毒性脑炎和不明原因发热病人的血清和脑脊液标本106份,用RT-PCR检测黄病毒属、甲病毒属、布尼安病毒属病毒核酸,结果有5份标本黄病毒属核酸阳性。阳性标本号为：JB114、JB135、DLN24、RLB61和RLC31。经进一步的核酸检测和序列测定分析,5份标本中,3株(JB114、JB135、DLN24病毒株)为乙型脑炎病毒,其中基因Ⅰ型2株(JB114、JB135),基因Ⅲ型1株(DLN24)；2株为登革病毒(RLB61和RLC31病毒株),其中登革1型1株(RLB61),登革3型1株(RLC31)。对检测到的3株乙脑病毒和2株登革病毒进行了分子流行病学特征分析。乙脑病毒JB114和JB135株来自西双版纳州景洪市的病毒性脑炎病人脑脊液,乙脑病毒DLN24株来自大理市病毒性脑炎病人脑脊液,这3例乙脑患者均为本地感染病例。登革病毒RLB61和RLC31均来自德宏州瑞丽市不明原因发热病人急性期血清,两例登革热病人均为输入性病例,其中1例为缅甸木姐边民入境就医的病人,另1例为瑞丽市边民到缅甸旅行返回后发病。首次从分子水平证实滇西边境地区存在登革热输入性病例,并证实2008年缅甸边境地区存在着登革1型和3型病毒的流行。本次106份标本中未检测出甲病毒属、布尼安病毒属核酸阳性标本。采用实时荧光PCR方法,对上述标本进行版纳病毒核酸检测,其中检测出版纳病毒核酸弱阳性标本2份(MNF40和MNF41),Ct值均为32。但用普通RT-PCR法检测版纳病毒核酸,MNF40和MNF41均未阴性。4结论云南省病毒性脑炎病例中存在基因Ⅰ型和Ⅲ型乙型脑炎病毒感染病例,其中来自西双版纳病人的病毒株为基因Ⅰ型,大理地区为基因Ⅲ型。乙脑病毒核苷酸和氨基酸同源性以及系统进化分析表明,自然界乙脑病毒具有较好的遗传稳定性。滇西边境地区存在有登革Ⅰ型和Ⅲ型病毒感染的输入性病例,间接证明了2008年夏秋季邻近我省的缅甸边境地区同时存在Ⅰ型和Ⅲ型登革病毒的流行。本次检测到的2株登革病毒与东南亚流行病毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高,系统进化分析表明他们之间的亲缘关系较近。今后应加强云南省边境地区的登革热防控工作,防止因输入性病例引发的本土流行。云南省病毒性脑炎病例中可能有版纳病毒感染病例的存在,应进一步开展版纳病毒与疾病关系的调查研究。