胃癌是全世界范围内恶性肿瘤死亡第二大原因，在中国居第三位，是严重威胁人民健康的一种恶性肿瘤。化疗是预防胃癌术后复发及转移的主要治疗方法之一。多药耐药（Multidrug resistance，MDR）是胃癌化疗失败的主要原因。我们科前期以耐阿霉素和耐长春新碱的胃癌细胞亚系7901/ADR和7901/VCR为模型，发现了一批胃癌多药耐药相关基因。然而目前ADR与VCR已经逐渐退出临床应用，且已知的耐药机制不能完全解释对胃癌多药耐药机制，临床上也还没有特别有效的胃癌MDR标志物。因此，建立新的针对目前胃癌ECF化疗方案的耐药细胞系，并通过高通量筛选技术，筛选新的胃癌MDR的标志物或治疗靶点，是MDR研究的主要方向之一，也是提高胃癌化疗效果，延长患者生存期的有效途径。基于蛋白质组学的iTRAQ技术能够同时对多个样本，筛选出MDR相关的关键蛋白，可用于筛选胃癌MDR相关标志物和治疗靶点。本研究拟用SGC7901胃癌细胞系作为亲本细胞，建立针对目前胃癌化疗ECF方案的主要化疗药物5-氟尿嘧啶、顺铂、表柔比星的耐药细胞亚系；并通过我们实验室已经具备的iTRAQ技术，筛选与胃癌多药耐药相关的关键差异蛋白，运用生物信息学分析方法，找出这些可能参与的相关分子通路。目的用SGC7901细胞作为亲本细胞，建立5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(CDDP)、表柔比星（EPI）三个胃癌耐药细胞亚系，利用基于蛋白质组学的iTRAQ技术筛选胃癌多药耐药相关的关键蛋白。方法采用我科前期悬浮培养的SGC7901胃癌干样细胞重新贴壁培养，5-氟尿嘧啶，顺铂，表柔比星对胃癌细胞系SGC7901进行耐药诱导，5-氟尿嘧啶从终浓度0.4μg/ml开始，顺铂从0.08μg/ml开始，表柔比星4ng/ml开始，逐步增加药物浓度，经过12个月的药物诱导，建立7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三个胃癌耐药细胞系。运用MTT、凋亡实验、阿霉素蓄积与潴留实验、免疫荧光染色、免疫印迹、侵袭与迁移实验等实验方法，对其生物学功能进行鉴定。通过iTRAQ技术对其差异表达的蛋白进行筛选，并运用MetaCore等生物信息学分析软件进行信息学分析。结果1.初步建立了7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三个胃癌耐药细胞亚系。7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI对5-氟尿嘧啶、顺铂、表柔比星的耐药指数分别为5.2、9.6和11.6。此外，三个新耐药细胞亚系对其他化疗药物也呈现不同的耐药性。2.三个新建立的耐药细胞亚系的耐药性与药物排出功能和抗凋亡能力增强有关。与亲本SGC7901细胞的排出指数0.140.01相比，7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI的排出指数分别为0.400.02（p<0.05），0.190.03（p>0.05），0.360.02（p<0.05）。进一步研究发现其药物排出能力的增强与耐药细胞系中ABC家族蛋白MRP1的表达上调有关。三个耐药细胞系与亲本SGC7901细胞相比，均显示较强的抗凋亡能力（p值均小于0.05）。Western blot显示抗凋亡蛋白Bcl-2在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI的表达与亲本细胞相比明显上调，而促凋亡蛋白Bax的表达明显下调，提示抗凋亡机制影响三个耐药细胞亚系的耐药性。3.长期药物诱导可以促进胃癌细胞发生EMT现象。实验过程中，我们发现三个耐药细胞亚系的形态学结构均发生明显改变。F-actin荧光染色结果显示，SGC7901细胞的骨架蛋白排列整齐，而三个耐药细胞亚系均有不同程度的细胞骨架排列紊乱。代表上皮表型的E-cadherin, β-catenin蛋白在SGC7901中表达较高，而在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI均表达下调。相反，代表间质表型的vimentin, slug, snail蛋白在SGC7901中表达较低，而在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI均显著上调，这些证据表明化疗药物可以诱导胃癌细胞发生EMT。进一步研究发现EMT增强了三个耐药细胞系的迁移和侵袭能力。4.筛选出了一批胃癌多药耐药的关键蛋白。我们进行了两次生物学重复的iTRAQ分析。在第一次iTRAQ实验结果中，共检出5930个蛋白。其中，与亲本细胞SGC7901相比,在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三个耐药细胞系中，蛋白表达差异倍数均大于1.2倍且经过统计学分析，p值均小于0.05的蛋白有18个；差异倍数均小于0.8倍且p值均小于0.05的蛋白有33个；第二次iTRAQ实验结果中，共检出5586个蛋白。其中，与亲本细胞SGC7901相比，在7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三个耐药细胞系中，蛋白差异倍数均大于1.2倍的且p值均小于0.05的蛋白有19个,倍数均小于0.8倍且p值均小于0.05的蛋白有25个。两次质谱的结果取交集，发现重复出现两次上调的，且具有统计学意义的蛋白有9个；重复出现两次下调的，且具有统计学意义的蛋白有10个。生物信息学对筛选得到的蛋白进行相关通路的富集分析显示，未折叠蛋白反应信号通路，细胞骨架重构通路，糖酵解和糖合成途径，糖皮质激素信号途径等多条通路，可能参与胃癌耐药。其中， endoplasmin和VCP蛋白参与内质网的未折叠蛋白反应与内质网应激相关信号通路，在多个富集分析方法中均显示具有统计学意义，提示未折叠蛋白反应可能是胃癌耐药细胞缓解外界刺激压力的重要途径和耐药相关的关键过程。细胞骨架相关蛋白可能也参与胃癌多药耐药特性的形成，我们筛选到的vimentin和keratin等蛋白可能是影响细胞骨架改变和耐药形成的关键蛋白，其中，vimentin的表达已经得到了western blot的验证。结论1.建立了7901/5FU、7901/CDDP、7901/EPI三个胃癌耐药细胞亚系；发现采用悬浮培养后的细胞重新贴壁培养，可以增加耐药细胞亚系的诱导成功率。2.三个耐药细胞亚系胃癌耐药性的形成可能与MRP1相关的药物转运机制和Bcl-2/Bax介导的肿瘤抗凋亡机制增强有关；3.不同化疗药物诱导均能够促使胃癌细胞发生EMT，侵袭和迁移能力增强，提示化疗药物在杀灭大部分肿瘤细胞的同时，可能促使小部分肿瘤细胞发生EMT，最终导致胃癌细胞的耐药和转移。4. iTRAQ是胃癌多药耐药相关蛋白筛选的有效工具；通过两次生物学重复的iTRAQ结果和生物信息学分析，发现endoplasmin、VCP等内质网应激相关蛋白，可能作为分子伴侣，参与未折叠蛋白反应，从而参与胃癌多药耐药。而vimentin等蛋白参与的细胞骨架重构可能是胃癌耐药的一个关键通路, western blot确认了vimentin的表达上调与胃癌耐药具有相关性。但仍需进一步进行多药耐药相关蛋白表达和功能的研究。