研究背景:脑血管病是人类三大致死性疾病之一,具有高发病率,高病死率,高致残率等特点,严重危害人类健康,并给家庭和社会带来沉重负担。其中,缺血缺氧性脑血管病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)约占全部脑血管病的85%,其发病是以局部血流以及梗死区的葡萄糖和能量供给突然中断为开端,继而引发严重的脑功能障碍。然而,脑供血供氧恢复后,神经损伤却仍在继续,其病理过程不仅是脑缺血及神经元死亡,再灌注损伤亦能加重脑损伤程度,导致神经功能障碍进一步加重,这一病理过程即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。CIRI包括一系列多环节、多因素、多途径损伤的病理级联反应,以往的研究主要针对特定神经元或血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)等单一结构,而未考虑多种因素间的相互作用。随着人们对大脑结构和功能的认识不断深入,这种对单一结构的研究逐渐转向对结构复合体,即神经-血管单元(neurovascular unit,NVU)的研究。NVU作为大脑结构和功能的基本单位,主要由神经元、胶质细胞和BBB等成分组成。研究显示,CIRI发生后,神经、血管的稳态关系遭到破坏,进而引发炎性因子的释放,血管内皮细胞、胶质细胞被激活,BBB通透性改变,神经元损伤加剧,NVU各组分不同程度的损伤。以NVU为研究对象,实现了对神经元-胶质细胞-血管内皮细胞整体结构的把握。神经保护和损伤修复对于HIE的防治具有重要意义。传统中药以其整体调节、辨证施治的特点,在CIRI的治疗方面具有得天独厚的优势。地黄作为我国“四大怀药”之一,是中医学中一味常用的药材。近年来,对地黄活性成分的分离、鉴定及药理学研究不断深入,其中最具代表性的为环烯醚萜类化合物梓醇(catalpol)。现代研究证实,梓醇具有神经保护、心血管保护、降血糖、抗肿瘤等广泛的药理学作用。梓醇能够通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、神经因子通路以及促进神经修复和重塑等途径,对多种神经系统疾病如脑缺血损伤、帕金森、阿尔茨海默及神经退行性疾病具有良好的治疗效果。然而,梓醇对CIRI在细胞水平的保护作用及其机制尚未阐明,明确梓醇对CIRI的保护作用将为神经保护机制的研究和药物筛选提供新的思路。研究目的:本研究的目的分为三个方面:首先,利用神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的多向分化潜能以及微流控芯片技术的高通量、集成化等特点,体外构建功能化NVU模型,为神经系统相关疾病的研究、潜在治疗靶点的筛选以及新药研发等提供条件;其次,在NVU模型基础上,探索适宜的氧糖剥夺/复氧糖(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)损伤条件,在细胞水平建立一种稳定可靠、简便易行的体外脑功能单元OGD/R损伤模型,为研究中药梓醇对CIRI的干预作用奠定基础;最后,探讨梓醇对NVU体外模型OGD/R损伤的干预作用,为神经保护机制的研究和体外药物筛选提供新的思路。材料方法:1、基于微流控技术的脑NVU体外模型的设计与构建收集孕6-12周的流产胚胎,体外分离、培养人神经干细胞(human neural stem cells,hNSCs),鉴定其干性、特异性及生长特性。体外培养人微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,hBMECs),鉴定其特异性及生长特性。利用CAD软件绘制微流控芯片设计图并打印胶片掩膜,采用软光刻技术制备SU-8阳模,聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)浇铸成型、打孔,下层芯片与玻璃基片等离子键合,上、下层芯片间置入附载有hBMECs的聚碳酸酯膜等离子键合,组装型、集成式、微通道NVU体外模型密封完成。利用血清促分化法,对接种于芯片模型中的hNSCs进行神经向诱导分化。利用实时定量PCR技术和免疫荧光染色法,对分化得到的神经元(Map2阳性)、星形胶质细胞(GFAP阳性)和少突胶质细胞(MBP阳性)的占比情况进行鉴定。利用免疫荧光染色法,检测NVU模型中hBMSCs表达vWF和紧密连接蛋白ZO-1的情况,考察内皮屏障的完整性;检测FITC标记的低分子右旋糖苷(4000 Da)的通过率,考察内皮屏障的渗透性。2、OGD/R损伤模型的建立在NVU模型基础上,设立正常对照组和OGD/R组。其中,OGD/R组需以无菌PBS灌注清洗模型上、下层细胞培养池,并将灌流液更换为无氧、无糖、无血清培养液,置于体积分数分别为1%O2、5%CO2和94%N2的三气培养箱内,缺氧培养3 h。OGD结束后,更换灌流液为常规完全培养液,并置于37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中复氧糖(R)培养,并于第0、6、12、24、48 h分别检测如下项目:应用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒,检测模型灌流液中LDH活性;应用Calcein-PI双染法,分别检测OGD/R损伤模型中神经-胶质细胞及hBMECs的存活率;以及利用FITC标记的右旋糖苷,检测OGD/R损伤模型中内皮屏障通透性的改变。3、梓醇对NVU体外模型OGD/R损伤的干预作用利用 CCK-8 法检测不同浓度梓醇(0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)对hNSCs及hBMECs生长活性的影响,考察应用剂量的梓醇对各细胞组分有无毒性作用。利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测梓醇在NVU模型中的透过率,考察应用剂量的梓醇透过BBB作用于神经-胶质细胞的效率。在成功构建的OGD/R损伤模型基础上,设立梓醇即时给药组(即OGD损伤后立即给予含梓醇的R液灌流)和预处理给药组(即OGD损伤前给予梓醇灌流培养12 h,且整个OGD/R过程中始终维持梓醇的作用),每组再分设低(0.05 mg/mL)、中(0.25 mg/mL)、高(1.0 mg/mL)三个剂量浓度,除正常对照组外均采用OGD 3 h/R 24 h处理。应用LDH检测试剂盒,检测各组灌流液中的LDH活性,评价损伤程度,进而确定梓醇的最佳给药方式和给药剂量。进一步采用Calcein-PI双染法,分别检测各处理组中hNSCs和hBMECs的细胞存活率;利用FITC标记的右旋糖苷,检测各组模型中内皮屏障的通透性变化情况,评价梓醇对NVU体外模型OGD/R损伤的干预作用。实验结果:1、依托神经干细胞和微流控芯片技术体外构建功能化NVU模型自提取的hNSCs,经鉴定能够稳定表达NSCs特异性蛋白(Nestin、SOX2),接种于芯片模型中经血清诱导7 d后,可稳定分化为神经元(Map2阳性)17.19 ±1.64%、星形胶质细胞(GFAP阳性)83.91±3.28%和少突胶质细胞(MBP阳性)2.21±0.15%。体外培养的hBMECs,经鉴定能够稳定表达内皮细胞特异性蛋白(CD31、vWF),接种于聚碳酸酯膜上5-7 d后,细胞间可形成紧密连接(ZO-1阳性)且稳定表达vWF。自发明微流控芯片,以PDMS为细胞附着材料,生物相容性好,神经-胶质细胞及hBMECs存活率均在95%以上。该模型由一个多层垂直的神经模块和血管模块叠加而成,二者分别连接有注射泵,提供了可控的细胞接种和物质传输条件,实现了 NVU的显著特征,如空间三维结构(神经模块+血管模块)、剪切应力(持续控速灌流)、细胞多样性(由hNSCs来源的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)等。与单纯的聚碳酸酯膜相比,NVU模型中的内皮屏障能够显著抑制FITC标记右旋糖苷的透过率,其完整性及渗透性良好。2、基于体外NVU构建OGD/R损伤模型将NVU体外模型OGD损伤3h后,进行复氧糖(R)处理,结果显示:R6h时,灌流液中LDH活性开始上升,并于R 24 h达到最大值;同时,神经-胶质细胞的存活率开始下降,且R 24 h后细胞存活率达到最低。R 12 h时,hBMECs存活率开始下降,并于R 24 h后达到最低;同时,模型中内皮屏障的通透性开始增大,R 24 h后稳定在最大值。由于当R达到48 h时,各检测指标与R 24 h相比,无显著性差异,且造模耗时长,不利于获得稳定的实验结果。因而,选择OGD 3 h/R 24 h作为后续研究的造模条件。3、探讨梓醇对NVU体外模型OGD/R损伤的干预作用不同浓度的梓醇(0.05 mg/ml、0.1 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml)分别作用不同时间点(24、48、72 h)后,均未对hNSCs和hBMECs的生长活性产生不利影响。利用反相HPLC法测定梓醇含量精密度良好、稳定性可靠,梓醇检测浓度在7.8125-1000 μg/mL范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。梓醇在NVU模型中的透过量随灌流时间的延长而增加,直至4 h后稳定,透过率为58.18±1.52%。与OGD 3 h/R 24 h组相比,梓醇预处理给药组中(0.25 mg/mL)、高(1.0 mg/mL)两种浓度可显著降低模型灌流液中LDH的活性;而梓醇即时给药组与OGD 3 h/R 24 h组相比,灌流液中的LDH活性无显著差异。1 mg/mL的梓醇以预处理给药的方式,可明显提高OGD/R损伤模型中神经-胶质细胞和hBMECs的存活率,有效缓解OGD/R损伤引发的细胞变性、坏死;同时保护内皮屏障功能,维持其完整性和渗透性;降低模型灌流液中LDH活性,减轻细胞损伤。结论:1、将hNSCs和微流控芯片技术相结合,成功构建出NVU体外模型。芯片模型组装便捷,实现了集空间结构(三维培养)、生理刺激(持续灌流、剪切应力)和细胞多样性(如交互共培养)于一体,hNSCs分化效率稳定,各细胞组分在芯片上存活率高。2、人NVU体外模型经OGD 3 h、R 24 h处理后,成功构建出OGD/R损伤模型。灌流液中LDH的释放水平可灵敏、便捷地反映损伤程度;内皮屏障通透性升高可作为判断OGD/R损伤建模成功的标志。3、治疗剂量的梓醇对各细胞成分均无毒性作用。梓醇能够缓解OGD/R损伤引发的细胞变性、坏死,减轻细胞损伤,抑制胶质细胞活化,保护内皮屏障完整性和渗透性,对人NVU体外模型OGD/R损伤具有保护作用,且预处理给药方式对OGD/R损伤的保护作用优于即时给药。