性别控制技术是指人为地干预动物的生殖过程,使得雌性动物生产出符合特定性别后代的一门技术,在畜牧研究中具有重要的应用意义。许多技术如流式细胞仪分离精子技术、性别相关基因沉默技术、早期胚胎性别鉴定、动物体细胞克隆技术等均可在一定程度上对不同物种有一定的性控效果,但是目前还没有一种技术可在不同哺乳动物上进行大规模的性别调控。因此,寻找一条有效,方便,快捷的性别调控方法至关重要。本研究通过转基因表达靶向Y染色体多拷贝基因Rbmy的CRISPR/Cas9系统来研究其对小鼠性别比例的影响,为日后家畜的性别控制技术研究提供基础。本研究针对Rbmy基因选择了6个靶位点,并在体外进行sgRNA介导的Cas9蛋白切割试验初选了两条最佳的sgRNA4和sgRNA6。利用精子生成后期特异的Protamine1启动子、胚胎发育早期特异的Trim43启动子以及全身表达启动子CMV分别构建三个共表达靶向小鼠Rbmy基因的sgRNA和Cas9的打靶载体。将CMV调控的打靶载体(载体一)转染到雄性小鼠来源的MLTC-1细胞,研究其对MLTC-1细胞的致死效率。另外通过受精卵原核显微注射线性化载体一的方法制备转基因小鼠,并研究注射的受精卵发育到囊胚及发育至出生的性别比例。研究结果发现:载体一转染组与阴性对照组相比,转染MLTC-1细胞12h-36h后,两组的绿色荧光细胞比例差异不大,说明两组的转染效率无显著差异,但转染42h-52h后,载体一转染组绿色荧光细胞比例显著少于载体二(阴性对照)转染组,且流式细胞术结果也显示转染42h后,载体一转染组绿色荧光效率为16.2%,低于载体二(阴性对照)转染组的27.8%,暗示载体一可切割Y染色体并致死MLTC-1细胞。囊胚性别鉴定的结果显示,注射载体一对胚胎发育至囊胚时的性别比例并无显著影响(p>0.05)。出生小鼠性别鉴定结果显示,注射载体一对胚胎发育至出生时的性别比例无显著影响(p>0.05)。此外,通过鉴定,在注射胚胎发育出生的68只F0代小鼠中,有7只(2公5母)为转基因小鼠,将5只雌性转基因小鼠繁育后,得到46只F1代小鼠,其雌雄比例为24/22,性别比例并未发生显著偏差。