目的:人延展多能性干细胞(extended pluripotent stem cell,EPS细胞),是由北京大学邓宏魁教授实验室于2017年基于小分子混合物培养基建立的一种新型多能干细胞。EPS细胞表达典型的多能性相关转录因子,如NANOG、OCT4、SOX2等;同时它会上调表达一些早期胚胎内细胞团相关转录因子,如KLF4、DNMT3L等。在胚胎嵌合能力上,EPS细胞显著区别于传统的始发状态的人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)和原始状态的小鼠胚胎干细胞,前者既可以嵌合进胚胎内组织,又可以嵌合进胚胎外组织例如胎盘等,后两者仅仅可以嵌合进胚胎内组织。因此无论从发育潜能和研究潜力而言,延展多能性干细胞相比其他多能干细胞具有不可取代的地位。但是目前无论是对于它的转化机理或是特定的分子标记都没有明确,它的培养体系也是基于饲养层体系,其复杂且并不清晰的成分也阻碍了进一步的分子机理研究。因此本研究想通过优化EPS细胞的培养体系并阐述其表观调控机理。表观遗传指的是不改变DNA序列、可在子代细胞间遗传的信息,通过某些机制引起可遗传的变化,如DNA和组蛋白修饰等。它不仅对可以影响基因的表达、调控、遗传,而且在发育、肿瘤及再生医学中也起着极其重要的作用。H3K27me3,指的是组蛋白H3上的27位赖氨酸的三甲基化修饰,可调节转录抑制。H3K27me3主要存在于基因密集区域的启动子中,并与发育调控因子,包括Hox和Sox基因密切相关,是控制发育调控因子的表观修饰信号。本研究旨在通过从H3K27me3来研究ES细胞与EPS细胞的表观遗传差异,并从抑制剂和基因编辑的手段来揭示ES细胞与EPS细胞中表观阻碍的功能性。方法:优化改进了一种简单易操作的、无饲养层细胞的EPS细胞培养体系,通过免疫荧光、流式细胞荧光分析、实时荧光定量PCR、RNA测序等手段鉴定ES细胞和EPS细胞的多能性基因表达情况以及H3K27me3的动态变化,摸索可以鉴定EPS细胞的分子指标,利用GFP标记的人EPS细胞嵌合进小鼠8细胞阶段的胚胎中,验证优化体系后EPS细胞的嵌合能力。其次,分别通过额外添加H3K27me3的甲基转移酶和去甲基化酶的抑制剂GSK126和GSKJ1、GSKJ4来验证H3K27me3是否是EPS细胞的表观阻碍,通过EPS细胞的立体克隆形态以及相应的分子指标来验证H3K27me3的变化是否有利于ES细胞向EPS细胞的转换。结果:基质胶(matrigel)体系中可以培养EPS细胞。EPS细胞中多能性基因NANOG与OCT4表达低于ES细胞,同时上调早期胚胎着床前基因KLF4和DNMT3L,下调晚期胚胎着床后基因DUSP6和ZIC2,人EPS细胞表现出优越的人鼠种间嵌合效率,并且胚胎免疫荧光中代表滋养外胚层的分子指标CDX2与GFP荧光共定位。在多能性状态转换过程中,H3K27me3的主要甲基转移酶EZH2表达会上调,而去甲基化酶KDM6A会下调;流式分析和Western blot结果都表明转换过程中H3K27me3逐渐升高。而抑制剂实验表明当额外添加H3K27me3的甲基转移酶EZH2的抑制剂时有利于促进ES细胞向EPS细胞的转换,而额外添加H3K27me3的去甲基化酶的抑制剂时则阻碍ES细胞向EPS细胞的转换;与此同时,通过基因编辑技术敲除KDM6A的HUES8无法转换为EPS细胞。结论:首先,通过改良的条件,基质胶条件下可以实现人ES细胞到EPS细胞的转化和维持,无论是从分子指标还是功能嵌合方面来比较,EPS细胞相比于传统的ES细胞而言是发育更早期的细胞系。其次,H3K27me3在EPS细胞中的水平高于ES细胞,但对于ES细胞向EPS细胞转换是不利的一种表观修饰。这部分数据对于体外研究人早期胚胎H3K27me3的动态变化提供了假设依据。