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肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤,是世界范围内癌症导致死亡的第三大主要类型。其主要特点为发病及死亡率高、肝内复发风险高并且预后差。目前,治疗肝癌的手段主要为手术切除和化学药物治疗,但是手术切除存在易转移复发等问题,而传统化疗药物也存在许多缺点,如靶向效率低、不良反应大、易耐受等。因此,寻找一种治疗效果好,毒副作用低的药物迫在眉睫。吴茱萸碱（Evodiamine,Evo）是从吴茱萸果实中提取的一种活性成分,具有抗炎、抗肥胖以及抗肿瘤的作用。近年来,已有许多研究人员发现,Evo可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,并促进其凋亡。并且有报道显示,Evo通过抑制核转录因子-?B（nuclear factor-κB,NF-?B）及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）的激活来发挥其抗癌作用,但其影响肝癌细胞增殖凋亡的具体机制,还需我们进一步研究。核苷酸结合寡聚样受体-1（Nucleotide-binding oligomerization domain 1,NOD1）是参与先天免疫的模式识别受体（pattern-recognition-receptors,PRRs）之一,而NOD1通路参与诱导NF-?B及MAPK的激活。此外,在GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中检索发现,NOD1在许多组织中均有表达,包括肿瘤组织,并且在癌组织与非癌组织中呈现明显的差异。因此,我们提出假设,Evo调控肝癌增殖凋亡可能与NOD1通路相关。目的本文首先以人肝癌细胞株SMMC-7721,HepG2以及HepG2裸鼠体内成瘤模型为研究对象,检测Evo在体内外对肝癌细胞增殖凋亡的影响;再在两种肝癌细胞株及正常肝细胞株HL-7702中检测NOD1的表达水平,并且研究Evo在体内外作用于肝癌细胞可能的机制,为临床应用吴茱萸碱治疗肝癌提供理论和实验依据。方法1.取处于对数生长期的SMMC-7721及HepG2细胞,接种于96孔板,待贴壁后分别加入终浓度为0、0.25、0.5、1、2、4?mol·L-1 Evo继续培养12,24,48h,用CCK-8法检测Evo对肝癌细胞增殖活性的影响。在肝癌细胞的培养体系中加入终浓度为0.5、1?mol·L-1 Evo培养24h后,进行Hoechst染色并在荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学改变;克隆形成实验检测Evo对细胞增殖的影响以及Western Blot检测凋亡相关蛋白P53、Bax、Bcl-2。2.采用HepG2细胞在裸鼠体内成瘤,通过测量肿瘤体积,重量,HE染色,TUNEL染色法检测在体内Evo对肝癌的影响。3.采用RT-PCR及Western Blot方法检测NOD1在两种肝癌细胞株及正常肝细胞株HL-7702中的表达情况;通过Western Blot及免疫荧光检测Evo在体内外对肝癌细胞中NOD1通路相关蛋白水平的影响。4.增加设置使用NOD1特异性激活剂IE-DAP预处理后再加入Evo组,采用Edu法检测Evo是否受IE-DAP影响改变对肝癌细胞增殖的抑制作用;FCM（Flow cytometry）法检测Evo对周期的影响是否发生变化;Western Blot检测凋亡及周期相关蛋白以及NOD1通路相关蛋白的表达是否改变。结果1.CCK-8法检测结果显示:Evo作用于HepG2及SMMC-7721细胞后,其增殖受到明显抑制（P<0.05）,且呈时间和浓度依赖性。Hoechst染色结果显示:随着药物浓度的增加,细胞核出现程度逐渐加重的核染色质浓集,核碎裂及蓝白色荧光等细胞凋亡的典型形态学特征。克隆形成实验结果表明:细胞增殖抑制情况随Evo浓度增加而加重。Western Blot结果显示:促凋亡蛋白Bax及P53表达明显增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低。2.体内实验结果:测量裸鼠瘤体体积及重量结果显示:较Control组,Evo组瘤体明显减小。HE及TUNEL染色结果表明:Evo组肿瘤组织出现明显的细胞损伤及死亡。3.RT-PCR及Western Blot结果显示:两种肝癌细胞中NOD1的表达水平均明显高于正常肝细胞中的表达。Western Blot及免疫荧光结果表明:Evo在体内外均可抑制NOD1的表达及NF-?B及MAPK的激活。4.采用IE-DAP预处理细胞后,较Evo单独用药组,Edu结果显示:IE-DAP削弱了Evo对肝癌细胞的增殖抑制作用。FCM（Flow cytometry）法检测细胞周期:IE-DAP使Evo阻滞周期的作用减弱。Western Blot结果显示:凋亡,周期及NOD1通路相关蛋白的表达均有不同程度的逆转。结论1.在肝癌细胞HepG2及SMMC-7721中,吴茱萸碱可能通过抑制Bcl-2的表达,促进Bax及P53的表达,抑制其增殖,诱导其凋亡。2.NOD1在肝癌细胞中高表达,吴茱萸碱可下调NOD1的表达,进而抑制MAPK及NF-?B的激活。吴茱萸碱可能是通过该途径呈现其抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡的活性。3.在体内吴茱萸碱可能是通过抑制NOD1通路发挥其抗肝癌的活性。