论文部分内容阅读
火龙果(Hylocereus spp.)是仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereus)或蛇鞭柱属(Seleniereus)植物,是近年来被广泛关注的一种新兴热带、亚热带水果。本研究通过对火龙果转录组测序获得的数据进行系统分析,建立火龙果SSR-PCR技术体系;以形态学差异显著的38份火龙果种质为材料进行引物验证筛选,旨在为火龙果种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建和分子标记辅助育种等提供更丰富的标记来源。具体研究结果如下:1)本文利用MISA软件筛选本实验室前期工作中对火龙果转录组测序获得的108,127条Unigenes,共检测出7,622个EST-SSR位点,其发生频率为6.02%,平均每9.00kb出现一个位点。单核苷酸重复类型占优势,占总EST-SSR位点的56.59%,其次是二核苷酸和三核苷酸,分别占28.4%和14.04%;其它特性重复类型数量较少,所占比例均不足1%。二核苷酸重复基元类型中以AG/CT、AC/GT为优势重复基元,分别占总SSR位点数目的25.37%和2.02%;三核苷酸重复基元类型以AAG/CCT为主,占总SSR位点数目的3.13%。2)基于火龙果转录组测序序列设计引物,以生物学性状差异明显的11份火龙果种质DNA为材料,采用正交试验设计,对影响火龙果EST-SSR-PCR扩增的2×Taq PCR MasterMix、引物及模板DNA浓度等因素进行了优化,在此基础上对变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度及上样量进行筛选确定。以期建立适合火龙果的EST-SSR-PCR最佳反应体系。结果表明,优化后的火龙果EST-SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:10μLPCR混合反应体系含模板DNA 30ng、1.2×PCR Mix和0.6μM的EST-SSR引物。在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中,利用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度、2.5μL上样量扩增效果最佳。3)设计合成125对EST-SSR引物,并随机选取8份形态学差异明显的火龙果种质提取基因组DNA,进行PCR扩增,采用2%的琼脂糖凝胶电泳和10%聚丙烯变性凝胶电泳对引物进行初步检测,筛选出32对扩增条带锐利清晰的引物。以38份火龙果种质为材料,对筛选出的引物进行多态性检测,获得16对多态性较好的引物,共扩增出47个多态性位点,多态信息含量(PIC)范围为0.243~0.667,多态性信息含量(PIC)的平均值为0.459,等位基因数(N a)的平均值为3,香农信息指数(I)的平均值为0.891。4)利用引物C31931、C13719和C32141等8种引物组合可以有效区分38份火龙果种质,构建其DNA的EST-SSR指纹图谱;UPGMA聚类分析,以0.62为阈值,可将38份火龙果种质分为3类:第一类包括红肉与粉红肉种质,第二类为白肉种质,第三类为蛇鞭柱属的两个种质。因此,基于火龙果转录组测序开发的EST-SSR标记,可为火龙果种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建等提供更丰富的标记来源。