CD4+CD25+T调节细胞是1995年Sakaguchi等首次报道的具有独特免疫调节作用的一种专职调节细胞。最初来源于胸腺，随后可在外周免疫器官持续产生。CD4+CD25+T调节细胞的数量很少，在人类健康个体的外周循环血液中仅占CD4+T淋巴细胞的5％～10％，但其在自身免疫性疾病、移植排斥反应和过敏性疾病中却发挥着重要作用。有证据表明，与正常人相比，哮喘患者CD4+CD25+T调节细胞在体外对Th2细胞的抑制功能减弱，但其功能活性的改变机制目前尚不清楚。最近的研究提示吸入抗原后，CD4+CD25+T调节细胞起着关键的免疫调节作用，也有研究显示哮喘患者体内存在严重的T淋巴细胞亚群失衡现象，尤其是调节性T细胞(regulatoryTcells，Tregs)紊乱导致的免疫耐受破坏在哮喘发病机制中扮演着重要角色。CD4+CD25+T调节细胞不但可以抑制Th1细胞，还可抑制Th2细胞应答，并且对后者的作用更强。CD4+CD25+T调节细胞可能通过调节Th1/Th2平衡，抑制抗原引起Th2细胞的分化而强化Th1细胞的活性，从而达到预防和治疗哮喘及过敏性疾病的目的。 CD4+CD25+T调节细胞作为一群调节机体免疫应答的重要细胞，本身也应存在一个被调节的过程，在微环境改变的情况下，它是如何被调控的呢？Fritzsching等的研究发现新鲜分离和体外培养的人CD4+CD25+T调节细胞均高表达CD95分子，并且可溶性CD95L及anti—CD95抗体均能有效诱导其凋亡，这提示CD4+CD25+T调节细胞可能存在AICD(activationinducedcelldeath)过程。人体内的CD4+CD25+T调节细胞的数量和功能的改变与自身免疫性疾病密切相关；体外扩增的CD4+CD25+T调节细胞则有利于自身免疫病的治疗及移植排斥反应的治疗；清除CD4+CD25+T调节细胞则有利于对肿瘤的治疗。因而，控制CD4+CD25+T调节细胞生死机制及策略的研究将为临床提供非常有意义的研究背景。 CD4+CD25+T淋巴细胞作为一类具有独特免疫调节作用的细胞受到广泛关注。从生物学活性方面来说，CD4+CD25+T调节细胞至少分泌两类抑制性细胞因子，即白细胞介素-10(interleukin—2，IL-10)和转化生长因子—β(transforminggrowthfactor—β，TGF—β)。研究发现TGF—β可诱导外周初始CD4+CD25+T调节细胞表达Foxp3(forkheadboxP3)，能使初始CD4+CD25+T调节细胞转化为具有调节活性的CD4+CD25+T调节细胞。TGF—β可通过抑制免疫效应细胞的增殖、分化以及抑制细胞因子的产生而发挥免疫抑制作用。另外，TGF—β被认为是哮喘气道重塑的主要调控因子，直接影响气道壁胶原沉积，促进纤维化的形成。此外，CD4+CD25+T调节细胞特异性表达的转录因子Foxp3与CD4+CD25+T调节细胞的免疫调节作用密切相关。Foxp3作为一类特殊的转录因子特异地高表达于CD4+CD25+T调节细胞，并与其发育和功能成熟密切相关，故有研究认为，Foxp3在一定程度上可反映CD4+CD25+T调节细胞的水平和功能活性。但亦有研究认为，Foxp3的表达并不与CD4+CD25+T调节细胞抑制活性成正比，其对于CD4+CD25+T调节细胞的活化是必需的，但尚不足够，可能还需要其他的调节机制。 CD137分子作为肿瘤坏死因子受体超家族的成员，与其配体交联后具有双向信号转导作用，可调节多种免疫细胞的功能。研究表明，CD137分子对于调节淋巴细胞生存具有重要作用，CD137分子表达异常可能与自身免疫性疾病及肿瘤发展密切相关，探索其作用机制对了解免疫细胞活化、增殖、凋亡、生存、移行及机体调节免疫细胞数量与功能的平衡均具有重要意义。有研究表明，CD137主要表达在T细胞表面，作为一种共刺激分子参与T细胞活化，亦在活化的CD4+CD25+T调节细胞表面表达，但其与CD4+CD25+T调节细胞免疫调节功能和Foxp3表达的相关性目前尚不清楚。 本实验我们通过观察抗CD137单克隆抗体干预健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞几种细胞程序性死亡方式的改变及与其分泌TGF—β水平和Foxp3的表达的相关性，探讨CD4+CD25+T调节细胞在哮喘发病机制中的免疫调节作用。 研究目的: 本实验拟首先观察在CD137单克隆抗体干预下健康人外周血CD4+CD25+T调节细胞的自噬、凋亡、胀亡这三种细胞程序性死亡方式与CD4+CD25+T调节细胞分泌的TGF—β的水平和其表面Foxp3的表达来了解CD4+CD25+T调节细胞的抑制功能与其自身的调控的相关性，并通过对比研究哮喘患者外周血中CD4+CD25+T调节细胞凋亡、自噬、胀亡这三种细胞死亡方式的变化，以及Foxp3的表达与TGF—β分泌，来进一步观察CD137单克隆抗体对哮喘患者上述指标的影响，拟更深入地了解CD4+CD25+T调节细胞在支气管哮喘的免疫发病机制中的作用。 第一部分共刺激分子CD137单克隆抗体对健康人外周血CD4+CD25+T调节细胞死亡方式影响的研究 一.方法: 经密度梯度离心法、尼龙棉柱法和磁分离法分离所得的健康人CD4+CD25+T调节细胞和CD4+CD25-T淋巴细胞，分CD137单克隆抗体组(不同浓度)及IgG1对照组培养后观察细胞电镜形态学，ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子TGF—β的水平并用流式细胞仪检测凋亡、自噬和胀亡细胞比例和CD4+CD25+T调节细胞的Foxp3表达情况。 二.结果: 1.MACS磁分离法可成功分离CD4+CD25+T调节细胞，纯度>70％。 2.2μg/ml的CD137单克隆抗体在72h时能够促进健康人外周血CD4+CD25+T调节细胞自噬的增加，而对于凋亡和胀亡则未观察到明显改变。通过相关性分析显示CD4+CD25+T调节细胞的三种细胞程序性死亡方式在CD137单克隆抗体作用后各自独立变化并未发现显著相关性。 3.2μg/ml浓度的CD137单克隆抗体不能诱导健康人外周血CD4+CD25-T淋巴细胞自噬、凋亡、胀亡增加。并且这三者之间在CD137单克隆抗体作用后各自独立变化并未发现显著相关性。 第二部分共刺激分子CD137单克隆抗体对哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞死亡方式影响的研究 一.方法: 经密度梯度离心法、尼龙棉柱法、磁珠分离法分离出哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞和CD4+CD20-T淋巴细胞，分CD137单克隆抗体组及IgG1对照组培养后ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子TGF—β的水平并用流式细胞仪检测凋亡、自噬和胀亡细胞比例和CD4+CD25+T调节细胞的Foxp3表达情况。 二.结果 1.2 μg/ml的CD137单克隆抗体在72h时能够促进哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞自噬、凋亡的增加，而胀亡则未观察到明显改变。通过相关性分析显示哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞的三种细胞程序性死亡方式在CD137单克隆抗体作用后各自独立变化并未发现显著相关性。 2.2 μg/ml浓度的CD137单克隆抗体不能诱导哮喘患者外周血CD4+CD25-T淋巴细胞自噬、凋亡、胀亡增加。通过相关性分析显示哮喘患者外周血CD4+CD25-T淋巴细胞的三种细胞程序性死亡方式在CD137单克隆抗体作用后各自独立变化并未发现显著相关性。 3.哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞能够分泌TGF—β，其值明显增高，并且CD137单克隆抗体进行干预后分泌更加旺盛，但是与健康组比较没有显著差异。哮喘患者外周血CD4+CD25-T淋巴细胞其分泌TGF—β的能力要远低于CD4+CD25+T调节细胞，但是要显著高于健康组。 4.哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞在CD137单克隆抗体的干预下胀亡与TGF—β的分泌呈显著负相关，提示哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞在CD137单克隆抗体的干预下胀亡的增加可能会有导致TGF—β分泌的下降的趋势。 5.CD137单克隆抗体未能明显影响哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞Foxp3表达强度，且与健康组一样，TGF—β分泌与Foxp3表达呈显著正相关。 全文结论: 1.CD137单克隆抗体能够促进哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞自噬、凋亡的增加。 2.CD137单克隆抗体干预后健康人和哮喘患者的外周血CD4+CD25+T调节细胞三种细胞程序性死亡方式有差异，并且各自独立变化，未发现明显相关性。 3.健康人和哮喘患者的外周血CD4+CD25+T调节细胞的TGF—β分泌均较旺盛，并且CD137单克隆抗体进行干预后分泌明显增加；而Foxp3表达强度组间没有明显变化，并且TGF—β分泌与Foxp3表达呈显著正相关。