人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究

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根据已发表的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)mRNA序列设计引物,以人乳腺第一链cDNA为模板,用PCR方法扩增出1.5 kb hLYZ双链cDNA,其推导的氨基酸序列与国外发表的从胎盘、巨噬细胞和结肠中克隆的hLYZ氨基酸序列同源性为100%,与从人组织细胞中克隆的hLYZ仅有1个氨基酸差异,但与从中国人胎盘中克隆的hLYZ具有6个氨基酸差异。将此cDNA亚克隆入真核表达载体pcDNA3和乳腺特异表达载体pCX中,用所获得的基因构件pcDNA3LYZ转染COS-1细胞进行暂态表达,用免疫荧光法检测到表达产物;用基因构件pCXLYZ注射哺乳期小鼠,经微球菌溶解试验证明,上述基因构件能有效地驱动目的基因在小鼠乳腺中表达,表达量为69.3μg/ml。 将序列正确的hLYZ cDNA克隆入乳腺特异表达载体p205C3,用获得的重组质粒p205C3LYZ注射正常奶牛乳腺,通过微球菌琼脂扩散法检测其乳汁中溶菌酶含量达1.18-1.96 μ g/ml,表达至少维持8天。3次共注射600 μ g重组质粒于患隐性乳腺炎的奶牛乳腺中,于注射后第2、6、10天分别采集奶样,通过奶样的C.M.T变化来判断治疗效果,其有效率分别为4/14、14/14、12/14。对比治疗试验显示,基因治疗和抗菌素治疗的有效率分别为86.4%(19/22)和88.9%(8/9),显著高于中药治疗组的有效率(69.2%,9/13)。治疗有效的奶牛乳腺炎症状消失,葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌及细菌总数明显减少,奶牛日均产奶量显著增高。用重组质粒对抗菌素治疗无效的18例临床型乳腺炎进行治疗试验,经一疗程治疗后除一例无效外,其余奶牛乳腺炎的红、肿、热、痛症状消失,乳汁颜色恢复正常。试验结果表明,含hLYZ cDNA的重组质粒p205C3LYZ对于奶牛乳腺炎具有良好的治疗效果。
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