课题背景：肝豆状核变性（Hepatolenticular degeneration, HLD）又名Wilson病（Wilson’s disease,WD），是由ATP7B基因突变所致的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病。世界范围发病率为1/10万～1/3万，致病基因携带者约1/90；临床主要表现为血清铜蓝蛋白降低、肝硬化、进行性加重的锥体外系症状、角膜K-F环（Kayser-Fleischer rings）及精神症状等。目前，国内外已经发现大量APT7B基因突变位点，但是对这些突变转录水平及其突变蛋白三维结构的研究仍然较少，而国内尚无相关报道。我们先前采用变性高效液相色谱法对华南地区75例WD患者ATP7B基因突变筛查，共筛查出38种突变，其中有10种为国内外首次报道的新突变。本研究采用常规PCR(Conventional Polymerase Chain Reaction)及巢式PCR（Nested Polymerase Chain Reaction）对6个新发现的突变位点（2620G>C、2761A>C、3446G>A、3682A>T、1875-1876insTTAA、3244-2A>C）及4个中国人常见的突变位点（2333G>T、2755C>G、3443T>C、1543+1G>T）进行ATP7B突变基因转录水平研究。通过在线预测软件ProtParam、Protscale、Mensat3分析突变及野生型ATP7B蛋白的理化性质、疏水性质、跨膜区结构。利用在线Swiss-Model软件进行野生型ATP7B核心区域及其跨膜结构的同源建模，以此模板研究这些突变对ATP7B蛋白三维结构的影响。目的：1．验证所发现的ATP7B突变基因是否从DNA转录到其mRNA。2．研究ATP7B突变蛋白理化性质、疏水性质、跨膜螺旋结构。3．得到ATP7B蛋白核心区域及跨膜螺旋区三维结构；并以此为模板进行ATP7B突变蛋白三维结构建模，分析突变对ATP7B蛋白结构功能的影响。4．对剪接位点突变：1543+1G>T、3244-2A>C进行转录水平研究。5．分析3244-2A>C、2333G>T杂合突变与2333G>T纯合突变患者基因型与表型的关系，探索两个不同突变点的遗传学意义。方法：1．提取外周血淋巴细胞总DNA及总RNA。2．采用常规PCR技术和巢式RT-PCR技术进行WD患者ATP7B突变基因（错义突变、移码突变、剪接突变）转录水平研究，验证ATP7B突变是否从DNA转录到其mRNA。3．通过在线蛋白质分析软件研究ATP7B突变蛋白理化性质、疏水性质、跨膜螺旋结构。4．利用在线同源建模软件得到ATP7B蛋白核心区域及跨膜螺旋区三维结构；并利用所建ATP7B蛋白三维结构模型进行ATP7B突变蛋白三维结构建模，分析突变对ATP7B蛋白结构功能的影响。5．使用巢式RT-PCR进行1543+1G>T、3244-2A>C剪接位点突变异常转录研究。6．收集3244-2A>C、2333G>T杂合突变与2333G>T纯合突变患者的临床资料、基因检测结果，进行基因型与临床表型研究。结果：1．本研究验证了先前筛查工作中筛查出的6个新发现及4个常见突变位点。其中7个错义突变2333G>T、2620G>C、2761A>C、2755C>G、3443T>C、3446G>A、3682A>T，1个插入突变1875-1876insTTAA，2个剪接位点突变1543+1G>T、3244-2A>C。2．本研究证实7个错义突变中有6个错义突变（2333G>T、2620G>C、2761A>C、3443T>C、3446G>A、3682A>T）从DNA转录到RNA中；剪接位点3244-2A>C在mRNA水平存在异常转录；剪接位点突变1543+1G>T未发现在mRNA水平有异常转录；插入突变1875-1876insTTAA未发现在mRNA水平表达。3．ProtParam蛋白质在线理化性质分析软件分析结果表明突变ATP7B蛋白存在不同程度理化性质的改变。4．利用Protscale在线蛋白质疏水性分析软件对Arg778Leu、Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr、Gly1149Glu ATP7B突变蛋白进行疏水性分析，发现Arg778Leu突变蛋白的氨基酸残基序列及其相邻序列疏水性升高，另外4个突变蛋白疏水性明显降低。5．通过Memsat3在线跨膜结构分析软件发现6个错义突变（Arg778Leu、Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr、Gly1149Glu、Arg1228Stop）及1个截短突变3244-2A>C均对跨膜结构产生影响；除Arg1228Stop突变外，其它5个错义ATP7B突变蛋白在第6个跨膜螺旋结构都发生相同的位置改变。6．Swiss-Model同源建模分析表明突变影响ATP7B蛋白的三维结构；本研究中的错义突变：Arg778Leu、Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr、Gly1149Glu都致使ATP7B蛋白三维结构发生明显改变：第2、第6跨膜螺旋区结构延伸，磷酸化区二个折叠结构、转导区1个折叠结构长度延长。突变蛋白的三维结构与野生型ATP7B蛋白叠加对比发现多数螺旋、折叠、卷曲等空间结构位置发生轻微变化。7．通过对1例3244-2A>C、2333G>T杂合突变患者与2例2333G>T纯合突变患者的基因型、临床表现等进行比较研究，结果预示3244-2A>C突变是一种预后严重的突变。结论：1．提取淋巴细胞总DNA及RNA能准确、快捷进行ATP7B转录水平的研究。2．通过ProtParam蛋白质理化性质分析表明，截短突变比错义突变更显著地改变ATP7B蛋白的理化性质，提示截短突变更严重地影响ATP7B蛋白的功能。3．Protscale蛋白质疏水性分析软件分析结果表明，Arg778Leu ATP7B突变蛋白疏水性发生明显升高，Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr及Gly1149Glu ATP7B突变蛋白疏水性发生明显下降；由于蛋白质氨基酸残基序列的疏水性与跨膜螺旋结构的形成密切相关，Protscale分析结果提示ATP7B蛋白氨基酸残基序列疏水性的变化可能引起跨膜螺旋结构改变。4．Memsat3跨膜结构分析软件分析结果表明：Arg778Leu、Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr、Gly1149Glu突变蛋白都存在部分跨膜螺旋结构改变，而第6个跨膜螺旋区跨膜位置的改变是它们都有的共同的改变。提示突变蛋白疏水性质的改变可能是跨膜螺旋位置改变的原因。5．利用蛋白质三维结构同源建模软件Swiss-Model成功进行野生型ATP7B蛋白三维结构建模。6．以所建野生型ATP7B蛋白三维结构为模板进行Arg778Leu、Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr、Gly1149Glu、3244-2A>C、3682A>T突变蛋白的建模。建模后与野生型ATP7B蛋白三维结构对比分析表明，这些突变蛋白的空间结构发生了改变，Arg778Leu、Ala874Ser、Ser921Arg、Ile1148Thr、Gly1149Glu突变蛋白跨膜区第2、第6跨膜螺旋结构、磷酸化区的二个折叠结构及转导区中的一个折叠结构都发生改变。这些突变引起的结构改变可能影响正常的铜转运功能。3244-2A>C突变后表达了截短的异常ATP7B蛋白，三维结构缺少了N区（大部分）、P区、TM7、TM8区；3682A>T突变后表达截短的ATP7B蛋白，三维结构中缺少P区（大部分）、TM7、TM8区；这两种截短的蛋白可能完全失去铜转运功能。7．剪接突变3244-2A>C巢式RT-PCR测序结果表明其在mRNA水平转录出一条比正常mRNA少13个碱基序列的mRNA，缺失的序列位于第15号外显子5’端前13个碱基。缺失的碱基序列数非3的倍数，将造成读码框位置的改变；转录后的异常m RNA序列在第1115个密码子出现终止子，使翻译提前终止，翻译出截短的蛋白。通过对1例3244-2A>C、2333G>T杂合突变患者与2333G>T纯合突变患者的基因型、临床表现等进行比较研究，结果预示3244-2A>C突变是一种预后严重的突变。8．通过分析剪接突变3244-2A>C突变位置和15号外显子的碱基序列，14号内含子3’端剪接识别位点AG突变为CG，不能被剪接酶识别。而在15号外显子5’端第12、13位置的碱基序列为AG，成为剪接酶识别的新剪接位点。这是导致ATP7B剪接突变3244-2A>C致异常转录体的分子机制，也是ATP7B基因突变致病的机制之一。