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研究目的：MicroRNAs (miRNAs)是近年来发现的一类细胞内源性小分子单链RNA，通常为18-22碱基大小，通过特异性的碱基配对，与靶向基因mRNA3’端非翻译区结合，引起靶基因mRNA的降解或者翻译抑制，参与对细胞编码基因转录后水平的表达调控。细胞miRNAs表达机制异常，可引起细胞生命活动改变，甚至发生癌变。前期研究表明，胃癌细胞过度表达COX-2是细胞癌变和胃癌发生发展的重要基础之一。本文旨在研究胃癌细胞miR-101的表达异常及其与胃癌细胞COX-2过度表达的关系，观察miR-101对胃癌细胞生物学功能和行为的影响，探讨抑制胃癌发生发展的新途径。研究方法：1.基于成熟miR-101与COX-2mRNA3’端非翻译区存在明显的互补序列。为探讨miRNA对胃癌细胞COX-2过度表达及细胞生物学功能和行为的影响，选择miR-101作为靶向调控COX-2表达的工具。2.应用miRNA逆转录病毒Lenti-virus载体系统（Invitrogene），构建含有pre-miR-101序列的慢病毒表达载体，制备含有pre-miR-101序列的重组慢病毒和不含miR-101的阴性重组病毒：将人工合成的miRNA-101前体序列(pre-miR-101)克隆到逆转录表达载体系统的pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR质粒中，转化DH5α感受态细胞，制备并纯化pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR101质粒DNA。使用GATEWAY技术，构建含有pre-miR-101序列的慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-miR-101。经PCR和DNA测序分析重组载体的pre-miR-101插入片段正确无误后，应用pLenti6.3/V5-miR-101和miRNA逆转录表达载体系统的其他元素pLP1、pLP2、pLP/VSVG（由miRNA逆转录表达载体试剂盒提供）共转染293T病毒包装细胞,制备含有pre-miR-101的重组慢病毒Lenti-miR，并同步制备不含pre-miR-101的阴性对照病毒Lenti-neg。测定Lenti-miR和Lenti-neg重组慢病毒滴度。3.重组慢病毒感染胃癌细胞株，建立和培养重组慢病毒稳定感染的胃癌细胞：通过Lenti-miR感染SGC-7901及BGC-823胃癌细胞株，将pre-miR-101序列转导入胃癌细胞。以杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选重组慢病毒感染细胞，建立并培养Lenti-miR稳定感染的胃癌细胞（Lenti-miR组，阳性重组病毒感染组），以SGC-7901和BGC-823亲代细胞（CON组，空白对照组）及它们的Lenti-neg阴性病毒感染的胃癌细胞（Lenti-neg组，阴性重组病毒感染对照组）作为各项研究指标检测的双重对照。4.应用qPCR检测Lenti-miR组细胞miR-101和COX-2mRNA表达情况；应用Western blot检测COX-2和PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen）蛋白水平的表达；观察miR-101和COX-2表达之间的相互关系；观察Lenti-miR感染SGC-7901和BGC-823胃癌细胞miR-101高表达后，胃癌细胞形态学，细胞凋亡及细胞增殖能力的改变,以及接种BALB/c-nu/nu裸鼠皮下后，裸鼠实验动物的饮食、活动、毛发等一般状况，体内转移瘤的成瘤能力和生长情况，以及移植瘤组织miR-101和COX-2表达。5.统计分析，各类研究指标，进行三次以上独立实验，定量和半定量资料以均数±标准差或标准误(X±SD or SE)表示，统计分析Lenti-miR组与CON组和Lenti-neg组的各项研究指标的差异。P<0.05为差异有显著意义，P<0.01为差异有非常显著意义。研究结果：1.经测序鉴定，构建的miRNA逆转录表达载体系统的重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR101和重组表达质粒pLenti6.3/V5-miR-101中插入的外源性pre-miR-101片段大小与预期相符，序列正确，无碱基突变、缺失、插入等异常发生。进而成功制备了能在宿主细胞正确表达外源性miR-101的重组慢病毒Lenti-miR，滴度为5.3×106pfu/ml，阴性对照重组病毒Lenti-neg滴度为5.6×106pfu/ml。2.重组病毒以MOI=1感染SGC-7901和BGC-823靶细胞，72小时后，倒置荧光显微镜下观察，表达绿色荧光的细胞比例约为90-95%。经用含有杀稻瘟菌素（Blasticidin）的培养基连续传代培养，建立了重组病毒稳定感染的SGC-7901和BGC-823胃癌细胞。3.实时荧光定量RT-PCR（qPCR）检测结果表明，SGC-7901及BGC-823细胞感染Lenti-miR后，miR-101均高度表达，其表达水平分别是相应Lenti-neg组细胞的10倍（SGC-7901）和12倍（BGC-823），差异有非常显著意义(P<0.01)。而Lenti-miR组细胞COX-2mRNA表达则分别比相应Lenti-neg对照组细胞下降58.0±11.2％（SGC-7901）和55.0±2.7％（BGC-823）（p<0.01，n=6）。与之相平行，COX-2蛋白水平的表达则较相应Lenti-neg对照组细胞下降66.0±11.5％（SGC-7901）和71.0±5.8％（BGC-823）（p<0.01，n=6）。因此，Lenti-miR稳定感染的SGC-7901和BGC-823细胞外源性miR-101高表达的同时，伴有COX-2表达显著降低，二者存在明显负相关性。然而，SGC-7901及BGC-823各自的两个阴性对照组即Lent-neg组和CON组细胞COX-2均维持异常高表达， miR-101也未见明显表达。由此可见,无论在mRNA水平和还是蛋白水平，这二个细胞株的COX-2表达均受到miR-101负调控。4. SGC-7901和BGC-823胃癌细胞感染Lenti-miR重组病毒后，细胞出现空泡、胞体增大、生长减缓等形态学和生物学行为方面的明显改变。生长曲线分析结果表明，培养72小时时段，Lenti-miR组细胞计数仅为同步培养的Lenti-neg组及CON组的41.2±8.0%（SGC-7901）和44.7±12.1%（BGC-823）(p<0.01， n=3)。与之相平行，Western blot分析反映细胞增殖能力的PCNA表达结果显示，Lenti-miR组细胞PCNA表达分别较相应Lenti-neg和CON对照组细胞下降74.0±7.6%（SGC-7901）和68.2±2.7%（BGC-823）(p<0.01， n=6)。5. FACS技术分析细胞凋亡结果显示，Lenti-neg组和CON组对照细胞几乎不发生细胞凋亡，凋亡细胞比例均接近于0。Lenti-miR组细胞凋亡明显，凋亡细胞比例分别占受检细胞总数的8.5±0.9%（SGC-7901）和16.8±1.3%（BGC-823）（p<0.01， n=6），并同时伴有G1，S和G2期比例改变。6. BALB/c-nu/nu裸鼠皮下接种胃癌细胞的的移植瘤成瘤实验显示，Lenti-miR组细胞移植瘤生长较慢、肿块小,在成瘤实验第20天（SGC-7901）或第24天（BGC-823），移植瘤体积分别为相应Lenti-neg对照组的44.2±11.4%（SGC-7901）和40.8±14.9%（BGC-823）(p<0.01， n=6)；瘤体重量分别为Lenti-neg对照组的37.9±11.0%（SGC-7901）和22.0±10.6%（BGC-823）(p<0.01，n=6)。7.qPCR检测移植瘤组织miR-101表达量，与相应对照组移植瘤组织相比，Lenti-miR组移植瘤组织miR-101表达量显著增加4倍~5倍(p<0.01, n=6)，而Western blot检测移植瘤组织COX-2蛋白表达水平，Lenti-miR组分别比相应对照组下降64.1±10.8%（SGC-7901）和66.9±6.3%（BGC-823）(p<0.01, n=6)。研究结论：1.本研究应用逆转录病毒载体Lenti-virus,成功制备了具有较高滴度的pre-miR-101重组慢病毒。2.SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株的miR-101表达异常，但pre-miR-101水平的加工过程是正常的。3.SGC-7901及BGC-823胃癌细胞株的亲代细胞和重组病毒感染细胞，miR-101与COX-2表达均呈明显负相关性，提示miR-101能有效负调控胃癌细胞中COX-2的表达。4.外源性miR-101高表达可引起SGC-7901及BGC-823胃癌细胞形态学改变，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡以及抑制实验动物体内成瘤和移植瘤生长等胃癌细胞生物学行为的改变。5.miR-101引起胃癌细胞生物学行为的改变，有可能是通过抑制或沉默COX-2表达实现的。miRNA-101的肿瘤抑制效应也为胃癌研究和抗肿瘤治疗提出了新的方向。6.逆转录病毒载体Lenti-virus是非常有效的转导miRNA-101的工具,为探索抑制胃癌细胞COX-2表达和胃癌防治提供了新思路。