人参基因组DNA转入酿酒酵母的初步研究及酵母新菌种的筛选

来源 :黑龙江八一农垦大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chu74042828
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人参皂苷是人参中重要的生理活性成分,具有抗癌、抗疲劳、抗老年痴呆等多种功能。如何大量、快速的获得人参皂苷是人参研究亟待解决的问题。微生物表达是解决这一难题最可能实现的方法,深受研究人员的广泛关注。在生物体中,人参皂苷合成途径已经基本明确:乙酰CoA经MVA途径转化为IPP,再由IPP转化为重要前体物质鲨烯,鲨烯经环氧化酶作用转变为环氧鲨烯,环氧鲨烯再经不同途径合成齐墩果酸型皂苷和达玛烷型皂苷。人参皂苷合成途径中的关键酶都已分别在酿酒酵母中成功表达,但该合成途径是在多种酶的作用下,经多步反应完成,在酵母中单一表达一种或几种酶是无法构成完整合成人参皂苷的通路的,这也是现阶段人参皂苷无法在微生物中表达中面临的最大问题。本试验,提取继代培养人参愈伤组织基因组DNA,并探索使用不同方法转入酿酒酵母中:1、人参基因组DNA转化至酿酒酵母感受态细胞中,使其整合到酿酒酵母的基因组中。2、将酿酒酵母涂布于含人参基因组DNA的固体培养基上,使其主动吸收外源基因,改变自身基因结构。3、人参细胞和酿酒酵母细胞融合,创造具有人参和酿酒酵母共同性状的子代细胞。试验通过无理性方法使人参基因组DNA与酿酒酵母基因组相互作用,将部分人参基因元件整合到酿酒酵母基因组上,用酿酒酵母的启动元件和表达系统表达人参中的蛋白或不完整的蛋白区域,更改或延长酵母中现有合成萜类的代谢通路,使酵母菌生产人参皂苷、前体或类似产物,也可为稀有皂苷生物转化提供菌株来源。实验通过荧光染料DAPI标记人参DNA,指示其在转化过程中的踪迹。实验发现三种方法都可以在一定程度上改变酿酒酵母,并产生一些代谢变化。转化法可使DNA直接进入酿酒酵母细胞内部,部分DNA片段可能整合到酿酒酵母染色体中。尽管平板法中的DAPI成分在高温灭菌处理后失效,无法追踪DNA在酿酒酵母培养过程中的走向和变化,但可喜的是酵母菌落形态发生了细微的变化,说明这种方法起到了一定的作用。观察人参细胞和酿酒酵母细胞的融合及培养融合细胞时发现,有一些异形细胞出现,但在培养过程中相继死亡或不生长,说明体细胞融合也可使人参细胞状态发生改变,但这种改变大多是有害的。实验应用表征法、薄层色谱法(PLC)和高效液相色谱法(HPLC)从众多的酿酒酵母菌株中筛选出一株独特的菌株,命名为Y828-15-1。在这株菌种中我们检测到两种尚未鉴定的产物,该产物在PLC鉴定中显色位置与人参皂苷Rh2和Rh1位置相近,但在HPLC鉴定时两种物质皆在亲水区被冲洗下来,说明该物质在以乙腈和水的流动相中表现出较高的亲水性,这与任意一种报道过的人参皂苷皆不相同。尽管这两种物质可能并非人参皂苷,但有可能是某种含较多糖基或后修饰过度的萜类。这种在酵母中的代谢变化是可喜的,也是有研究价值的。这两种物质的性质和结构还需进一步确定,菌种的遗传性质和稳定程度还需进一步考察。
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