背景与研究目的心肌梗死是导致全球冠心病病人死亡的主要原因。经过早期溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗恢复缺血部位的血流灌注,尽管能有效挽救受损的心肌组织,改善心肌缺血、坏死,但仍会伴随部分心肌细胞死亡和心脏功能的丧失[1,2],即缺血再灌注损伤。目前造成缺血再灌注损伤的潜在细胞机制仍不完全清楚。microRNA （miRNA）是一类内源性非编码的单链小RNA分子,通过靶向结合特定RNA的3’端非编码区,促进RNA降解和抑制蛋白翻译,从而负性调节基因和蛋白表达,所以microRNA能调控复杂的病理和生理过程[3-6]。而microRNA在心肌缺血再灌注损伤中的作用日趋受到重视[7-12],提示miRNA可能成为缺血再灌注损伤新的治疗靶点。近期研究结果表明miR-15家族在心肌缺血和心力衰竭中起着重要作用[13-15]。miR-15家族主要有5个成员,包括miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-195和miR-497,它们有相似的5’端种子序列和许多共同的作用靶点,因此它们可能有相似的调控作用[16,17]。据文献报道miR-15和miR-16通过靶定Bcl-2诱导凋亡[18]；心梗小鼠注射抑制miR-15的化学试剂可减少心梗面积[15]；抑制miR-15a或miR-16可促进心肌缺血后的血管新生[19]；miR-195能促进心肌细胞凋亡[20]。然而,关于miR-497的研究甚少,其在心肌细胞和心脏中的具体作用仍不清楚。我们通过生物信息学分析发现抗凋亡基因Bcl-2和自噬相关基因LC3B是miR-497的预测靶基因,许多文献曾报道这两个基因均参与缺血再灌注过程。在非心肌细胞的研究中,发现miR-497能通过负性调节Bcl-2和Bcl-w[21]促进缺血性神经元凋亡,也能作为肿瘤抑制因子在肿瘤发生过程中起调节作用[22,23]。过表达miR-497增加人神经母细胞瘤细胞中活性氧自由基形成,破坏线粒体膜电位以及诱导释放细胞色素C[24]。上述研究结果提示miR-497可能在心肌缺血和心力衰竭中发挥重要作用。本课题旨在揭示miR-497在心肌细胞缺氧复氧和心肌组织缺血再灌注损伤中的调节作用及其机制,为心肌缺血再灌损伤提供新的治疗靶点。研究方法1.心肌梗死和缺血再灌注模型的建立和处理选择8-10周龄,体重约20-25克的C57BL/6雄性小鼠,制作心梗模型和心肌缺血再灌注模型。心梗（MI）实验中分为3组,分别为（1）假手术组（Sham组）；（2）心梗2周组（MI 2w）；（3）心梗4周组（MI 4w）。制备的小鼠模型于2w和4w后取心脏做实时定量PCR （realtime PCR）和vestern blot （WB）。缺血再灌注（IR）实验分为5组,分别为（1）Sham组；（2）IR+Scramble组（3）IR+Ad-miR-497组（miR-497过表达）；（4）IR+vector组：（5）IR+Ad-miR-497-sponge组（miR-497敲低）。24h后取心脏做TTC染色、石蜡切片、电镜切片。2.细胞分离培养和细胞转染原代分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞（NRCs）后,采用2种nicroRNA转染细胞的方法,分别为（1）阳离子脂质体转染心肌细胞,将双链成熟miR-497（miR-497 mimic）瞬时转染至心肌细胞过表达miR-497,36h后收集细胞提取RNA, realtime PCR检测miR-497的表达水平,评价转染效率,以备后续实验。（2）腺病毒感染心肌细胞,分别将过表达miR-497 （Ad-miR-497）、敲低miR₄97（Ad-miR-497-sponge）或沉默beclin-1的腺病毒（Ad-sh-beclin-1）直接感染细胞,48 h后显微镜下观察细胞表达GFP蛋白的绿色荧光,并行WB检测Beclin-1蛋白表达量,评价病毒转染效率,以备后续实验。3.缺氧复氧心肌细胞模型的建立和MTT细胞存活实验SD大鼠乳鼠心肌细胞分离培养48h,饥饿24h后将培养皿置入低氧环境中3h、6h或24h,后复氧2h。利用realtime PCR检测miR-497表达水平。或心肌细胞感染病毒48h后,加药物预处理30min,行缺氧3h复氧2h （A 3h/R 2h）刺激,以备后续实验。心肌细胞分别过表达或敲低miR-497后A3h/R2h刺激,MTT法检测细胞存活率。4.实时荧光定量PCR检测microRNA含量提取心肌细胞或心肌组织总RNA,取microRNA专用逆转录试剂盒取10 ngRNA逆转录成cDNA,用nicroRNA特异性引物行realtimePCR检测niR-497的表达水平,U6作为内参。5.心肌细胞和组织的凋亡自噬检测手段将原代SD大鼠乳鼠心肌细胞接种于P3.5 cm的小皿,行相应刺激处理后,分别经末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记法（TUNEL）和Hoechst染色检测细胞凋亡。利用单丹磺酰尸胺（Monodansylcadaverine, MDC）荧光染料标记自噬体和透射电镜（Transmission electron microscope, TEM）观察自噬体。Western Blot检测Bcl-2, Bax, LC3B, Beclin-1, P62等凋亡和自噬相关蛋白表达。心脏组织制作石蜡切片后,用TUNEL染色检测凋亡,TEM观察自噬体形成。Western Blot检测Bcl-2,LC3B等蛋白表达。结果1.miR-497表达随心梗或心肌细胞缺氧时间延长而逐渐下调Realtime PCR检测miR-497均在小鼠的心、肺、肾、肝、脑组织中表达,尤以心脏中表达最高。随着小鼠心梗时间延长,miR-497表达随之下调。在细胞水平,单纯缺氧3h,6h,miR-497表达无明显变化,但在缺氧24h后表达明显下降。而心肌细胞缺氧后均相应复氧2h,与常氧组相比,miR-497在A 3h/R 2h时表达已明显下调,并随着缺氧时间延长,miR-497表达进一步下调。上述结果提示miR-497可能参与心肌缺血特别是再灌注损伤的病理生理过程,表明miR-497与缺血再灌注损伤更为相关。基于以上结果,在后续实验中,我们选择了A 3h/R 2h作为刺激细胞条件。2. Bcl2和LC3B是miR-497的直接靶基因利用数据库TargetScanHuman6.2和miRanda对miR-497的靶基因进行预测,挑选出抗凋亡基因Bcl-2和自噬相关基因LC3B作为研究对象。WB检测发现心梗2w和4 w的心肌组织中Bcl-2和LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平均较Sham组显著升高。在细胞水平,心肌细胞单纯A 3 h/R 2 h刺激后,Bcl-2蛋白表达下降,LC3B-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达显著上升。3. miR-497-mimic诱导心肌细胞凋亡和自噬心肌细胞转染50nM miR-497 mimic 36h后,经realtime PCR鉴定,与对照组相比,转染组miR-497表达升高2倍以上。Hochest染色和TUNEL法发现心肌细胞单纯转染miR-497 mimic或单纯给予A 3h/R 2h刺激后,细胞凋亡显著增多。转染miR-497 mimic后给予A3h/R2h刺激,心肌细胞凋亡较单纯A3h/R2h刺激增多。说明转染miR-497 mimic促使A 3h/R 2h刺激引起的凋亡进一步增多（P<0.01）。MDC是标记自噬体的特异性染料,MDC孵育细胞后共聚焦显微镜下观察,心肌细胞单纯过表达miR-497自噬体数目无明显变化,单纯A3h/R2h刺激可诱导自噬体增加。而转染IniR-497 mimic的心肌细胞再给予A 3h/R2h刺激后自噬体形成较单纯A 3h/R 2h刺激时减少,表明miR-497能减少缺氧复氧刺激诱导形成的自噬体。同样,应用TEM可观察到以上相同的结果。上述结果表明单纯缺氧复氧刺激诱导心肌细胞凋亡和自噬体增加；过表达miR-497增加缺氧复氧诱导的细胞凋亡,减少缺氧复氧诱导的自噬体形成。说明过表达miR-497在心肌细胞中有促凋亡和抗自噬的作用。4. miR-497-sponge少心肌细胞凋亡,增加自噬体形成心肌细胞转染Ad-miR-497-sponge 48h后,荧光显微镜下观察发现90%以上的细胞表达GFP绿色荧光蛋白。应用Hochest染色和TUNEL法发现单纯感染Ad-miR-497-sponge并不影响常氧状态下的细胞凋亡,而单纯A 3h/R 2h刺激增加心肌细胞凋亡。抑制miR-497后给予A3h/R2h刺激,心肌细胞凋亡较单纯A3h/R 2h刺激减少。MDC检测显示心肌细胞单纯感染Ad-miR-497-sponge自噬体无变化,单纯A 3h/R 2h刺激增加心肌细胞自噬体形成,心肌细胞感染Ad-miR-497-sponge后给予A3h/R2h刺激,自噬体较单纯A3h/R2h刺激进一步增加。以上结果说明抑制miR-497可以减轻缺氧复氧所致的心肌细胞损伤。5.miR-497影响凋亡和自噬相关蛋白的表达WB结果表明转染miR-497 mimic的心肌细胞,Bcl-2, LC3B-Ⅱ和beclin-1蛋白表达明显减少, Bax表达增加。而敲低miR-497与上述作用相反,并通过下调P62增加自噬流。基于以上结果,我们想进一步探究敲低miR-497与自噬流的关系。应用沉默beclin-1的腺病毒（Ad-sh-beclin-1）感染心肌细胞,或者加入溶酶体抑制剂巴弗洛霉素（Baf）或自噬抑制剂渥曼青霉素（Wor）等不同方法检测LC3B-II蛋白表达。结果发现Baf使LC3B-Ⅱ蛋白表达增加,而沉默beclin-1和Wor拮抗这一作用,反证敲低miR-497加强自噬流。以上结果在细胞水平上证明了过表达miR-497促进细胞凋亡抑制自噬,而敲低miR-497减少细胞凋亡,通过下调P62加强自噬流。6.miR-497影响缺氧复氧条件下细胞凋亡和自噬相关信号蛋白的表达过表达或敲低miR-497的心肌细胞接受A 3h/R 2h刺激,LC3B-Ⅱ, beclin-1,Bcl-2和Bax均发生显著变化。我们发现过表达miR-497的心肌细胞接受A 3h/R2h刺激后,Bcl-2, LC3B-Ⅱ和beclin-1蛋白表达减少,而Bax表达增加。不论敲低或过表达miR-497,加入Baf后与相应的对照组比beclin-1, LC3B-Ⅱ以及Bax的蛋白表达均增加,说明过表达miR-497抑制自噬流可激活细胞凋亡信号通路。而MTT细胞存活实验说明单纯过表达或敲低miR-497不影响细胞存活性,敲低miR-497后给予心肌细胞A 3h/R 2h刺激,可改善单纯缺氧复氧刺激所致的细胞存活率降低。7.心肌注射Ad-miR-497-sponge缩小心梗面积为了阐明敲低心肌miR-497对缺血再灌注损伤的影响,我们于心肌直接注射Ad-miR-497-sponge或Ad-miR-497,2d后行冰冻切片确认病毒感染效率达60%以上,注射病毒3d后制备心肌缺血再灌注模型。与Sham组相比,IR组miR-497表达明显下调,而注射Ad-miR-497-sponge的IR组, miR-497进一步下调。单纯注射Ad-miR-497的心肌组织miR-497表达显著上调,而注射Ad-miR-497的IR组,miR-497表达的上调幅度减少。TTC染色发现与注射空载腺病毒组相比,注射Ad-miR-497-sponge组的心梗面积缩小,而注射Ad-miR-497组的心梗面积扩大。TEM观察发现注射Ad-miR-497-sponge组的缺血再灌注小鼠心肌组织自噬体增加,TUNEL法显示其凋亡减少,而注射Ad-miR-497组的结果与之相反。结论1.心肌缺血和心肌细胞缺氧复氧刺激时,miR-497表达水平明显下调,而其预测靶基因Bcl-2和LC3B蛋白表达相应上调,提示miR-497在缺血再灌注损伤时起重要作用。2.过表达miR-497增加心肌细胞凋亡,抑制自噬流；而敲低miR-497减少心肌细胞凋亡,加强自噬流。敲低心肌细胞miR-497可改善缺氧复氧所致的细胞存活率下降。3. 敲低心肌miR-497缩小心肌缺血再灌注小鼠的心梗面积,提示miR-497可以作为心肌缺血再灌注损伤的一个新的治疗靶点。