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目的构建MTB ClpC2基因原核表达质粒，在大肠埃希菌（Escherichia.coli, E.coli）BL21中表达rClpC2蛋白；rClpC2蛋白经亲和层析法纯化后免疫新西兰大白兔，制备兔抗ClpC2多克隆抗体（anti-rClpC2抗血清）；间接ELISA法检测肺结核病人血清中相应的抗原、抗体，判断rClpC2和anti-rClpC2抗血清分别作为检测抗原或抗体的特异性和敏感性，为结核病早期诊断提供实验依据。在E.coli BL21中过表达重组蛋白，观察E.coli BL21在各种应激条件下的生长情况，为后续深入研究MTB ClpC2蛋白酶的生物学功能奠定实验基础。方法1.以MTB H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增ClpC2基因，插入表达载体pET32a(+)中，构建重组原核表达质粒pET32a(+)/ClpC2并转化E.coli BL21，IPTG诱导蛋白表达，利用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定。2.纯化后的rClpC2与等体积的弗氏佐剂充分混合，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，于第五次免疫后的第七天采血，通过Western-blot检测anti-rClpC2抗血清的特异性；双向免疫扩散法和间接ELISA检测anti-rClpC2抗血清的效价；rClpC2通过间接ELISA进行抗原性的初步检测，anti-rClpC2抗血清通过间接ELISA检测肺结核病人血清中ClpC2抗原，判断rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗体分别作为检测抗原或抗体的特异性和敏感性。3.通过检测各组菌液OD600观察过表达ClpC2或ClpP1蛋白及共表达ClpP1和ClpC2蛋白的E.coli BL21的生长曲线及其在氧化应激、酸应激、碱应激、乙醇应激条件下的生长状况；采用结晶紫半定量法检测蛋白过表达对E.coli BL21生物膜形成的影响。结果1.重组原核表达质粒pET32a(+)/ClpC2双向测序结果显示与ClpC2基因序列完全一致，表达的融合蛋白Trx-ClpC2相对分子质量为46000，可与MTB H37Rv株免疫的小鼠血清发生抗原抗体反应。2.纯化的rClpC2纯度约为88.5%，Western-blot验证anti-rClpC2抗血清的特异性；ELISA测得anti-rClpC2抗血清的效价为1:320000，双向免疫扩散法测得anti-rClpC2抗血清的效价为1:32；rClpC2在检测肺结核病人中的相应抗体检出率为46%，检测敏感性为46%，特异性为90%；anti-rClpC2抗血清在检测肺结核病人中的相应抗原检出率为40%，检测的敏感性为40%，特异性为90%。3.过表达ClpP1蛋白的E.coli BL21对过氧化氢的耐受增加，共表达ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21的生长；共表达ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21抵抗酸应激、碱应激；重组蛋白的过表达并未对E.coli BL21生物膜的形成起促进作用。结论1.成功构建重组原核表达质粒pET32a(+)/ClpC2，并在E.coli BL21中表达ClpC2蛋白。2.成功制备兔抗ClpC2多克隆抗体，并初步应用于MTB感染的诊断。3.ClpP1蛋白与E.coli抵抗氧化应激有关；共表达ClpC2和ClpP1蛋白与E.coli抵抗酸应激、碱应激有关。