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第一部分自然衰老对小鼠LOXL2表达水平及骨骼肌结构和功能的影响目的赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）是一种铜依赖性单胺氧化酶,其功能是催化细胞外基质（ECM）中弹性蛋白和胶原蛋白的交联。研究证实LOXL2参与上皮间质转化、ECM沉积和纤维化相关疾病的发生与进展。然而,LOXL2在骨骼肌纤维化发生过程中的作用尚不清楚。本研究探讨自然衰老对LOXL2表达水平及骨骼肌结构和功能的影响,为进一步探究LOXL2作为肌肉减少症的治疗靶点提供理论依据。方法对青年组（4月龄）和老年组（20月龄）C57BL/6J小鼠体重和抓力进行检测;利用双能X线吸收测量法（DEXA）对麻醉后青年组和老年组小鼠身体成份进行检测。根据骨骼肌功能和质量,筛选出符合肌肉减少症表现的小鼠。各组随机选取3只小鼠,依据体重进行麻醉后灌注通用型组织固定液。固定后,分离小鼠双侧腓肠肌,蔗糖溶液梯度脱水后,进行石蜡包埋切片并对切片进行H＆E染色、天狼星红染色和LOXL2免疫组化染色。其余小鼠麻醉后处死,于冰上迅速分离小鼠双侧腓肠肌,剪取约50 mg腓肠肌组织加入含有1%PMSF的RIPA裂解液中,使用低温组织研磨仪充分研磨裂解后高速离心获得组织上清液。测定上清液蛋白浓度后,利用Western blotting检测myogenin,Fbx O32,TGF-β1,α-SMA和LOXL2的蛋白表达水平。结果1、体重结果显示:与青年组相比,老年组小鼠体重显著减轻。2、抓力结果显示:与青年组相比,老年组小鼠相对抓力显著减小。3、DEXA检测结果显示:与青年组相比,老年组小鼠瘦体重,后肢瘦体重显著减小。4、H＆E染色结果显示:与青年组相比,老年组小鼠肌纤维横截面积显著减小;肌源性转录调节因子myogenin表达水平显著下降;肌萎缩蛋白Fbx O32表达水平显著升高。5、腓肠肌天狼星红染色结果显示:与青年组相比,老年组小鼠腓肠肌胶原蛋白阳性区域显著增大;老年组小鼠腓肠肌TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平显著升高。6、腓肠肌LOXL2免疫组化染色结果显示:与青年组相比,老年组小鼠腓肠肌LOXL2阳性细胞显著增加;老年组小鼠腓肠肌LOXL2蛋白表达水平显著升高。结论1、自然衰老引起小鼠骨骼肌功能和质量的下降。2、自然衰老引起小鼠出现明显骨骼肌纤维化。3、自然衰老引起小鼠骨骼肌中LOXL2表达升高。第二部分过表达及沉默LOXL2介导成纤维细胞调控骨骼肌纤维化目的探讨过表达及沉默骨骼肌成纤维细胞中LOXL2对骨骼肌纤维化的作用,为后续探究LOXL2参与骨骼肌纤维化的信号通路提供理论基础。方法（一）建立过表达LOXL2成纤维细胞模型:小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50-60%融合时,向成纤维细胞内转染LOXL2过表达质粒,孵育72小时后收集细胞;（二）建立D-半乳糖诱导成纤维细胞衰老模型:成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50-60%融合时,向完全培养基中加入不同浓度（10,15,20,30,40 g/L）的D-半乳糖,以诱导成纤维细胞衰老,孵育72小时后收集细胞;（三）沉默D-半乳糖诱导成纤维细胞中LOXL2:成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50-60%融合时,向成纤维细胞内转染si RNA-LOXL2以沉默LOXL2,并向完全培养基中加入D-半乳糖以诱导衰老,孵育72小时后收集细胞。获得的细胞进行CCK-8细胞增殖实验;衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色;Collagen-I和TGF-β1免疫荧光染色;细胞内ROS荧光染色和流式细胞检测;细胞内三磷酸腺苷（ATP）含量检测;线粒体Mito SOX染色、线粒体膜电位TMRE及JC-1染色;衰老相关蛋白,纤维化相关蛋白及LOXL2m RNA和LOXL2蛋白表达水平检测。结果1、与Ad-NC组相比,Ad-LOXL2组LOXL2蛋白表达水平明显升高;Collagen-I和TGF-β1的荧光强度显著增加;纤维化相关蛋白的表达水平显著增加;p-p38与p38表达水平比值显著增大。2、与对照组相比,40 g/L D-半乳糖显著抑制成纤维细胞的生长;D-半乳糖组SA-β-gal阳性细胞显著增多;衰老相关蛋白p53和P16INK4a的表达水平显著升高;LOXL2表达水平显着升高;纤维化相关蛋白的表达水平显著增加;细胞内ROS产生显著增加;细胞内ATP含量显著降低;线粒体ROS产生显著增加;线粒体膜电位显著降低。3、与si RNA-NC组细胞相比,si RNA-LOXL2组LOXL2表达水平显著降低;SA-β-gal阳性细胞显著减少;衰老相关蛋白表达水平显著降低;Collagen-I和TGF-β1的荧光强度显著降低;纤维化相关蛋白的表达水平显著降低;细胞内ROS的产生显著降低;线粒体膜电位显著升高;p-p38与p38表达水平比值显著减小。结论1、过表达LOXL2促进成纤维细胞胶原蛋白沉积并引起p38磷酸化增加。2、D-半乳糖诱导骨骼肌成纤维细胞衰老和细胞外胶原蛋白沉积、LOXL2表达水平升高、ROS产生增加并损害线粒体功能。3、沉默LOXL2改善D-半乳糖诱导成纤维细胞衰老和胶原蛋白沉积、抑制ROS的产生、保护线粒体功能并抑制p38磷酸化。第三部分LOXL2通过TGF-β1/p38 MAPK通路调控成纤维细胞参与骨骼肌纤维化目的探讨应用p38 MAPK抑制剂对（1）过表达LOXL2的成纤维细胞和（2）施用选择性LOXL2抑制剂的D-半乳糖诱导成纤维细胞的作用,以明确LOXL2调控骨骼肌纤维化的信号通路,为后续动物研究提供实验基础。方法（一）小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50%融合时,对成纤维细胞转染LOXL2过表达质粒,并施用选择性p38 MAPK抑制剂（SB 203580）,孵育72小时后收集细胞;（二）小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50%融合时,向完全培养基中加入30 g/L D-半乳糖同时加入不同浓度（0.25,0.5,1μM）选择性LOXL2抑制剂,培养72小时后收集细胞;（三）小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50%融合时,向完全培养基中加入30 g/L D-半乳糖及选择性LOXL2抑制剂（HY-101771A）和p38 MAPK抑制剂（SB 203580）,培养72小时后收集细胞。获得的细胞进行SA-β-gal染色;Collagen-I和TGF-β1免疫荧光染色;细胞内ROS流式检测;细胞内ATP含量检测;线粒体Mito SOX染色;线粒体膜电位染色;衰老相关蛋白,纤维化相关蛋白及LOXL2,p38,p-p38蛋白表达水平检测。结果1、与Ad-LOXL2组相比,SB 203580组磷酸化p38表达水平显著降低;Collagen-I相对荧光强度显著减小;Vimentin和α-SMA表达水平显著降低;ROS产生减少;线粒体膜电位升高;2、与D-半乳糖组相比,随着选择性LOXL2抑制剂浓度升高,SA-β-gal阳性细胞逐渐减少;0.5和1μM LOXL2抑制剂显著降低衰老相关蛋白表达水平;Collagen-I的相对荧光强度显著减低;1μM LOXL2抑制剂显著降低纤维化相关蛋白表达水平;细胞内ROS的产生显著降低;细胞内ATP含量显著增加;线粒体ROS产生显著减少;线粒体膜电位显著升高。3、与LOXL2抑制剂组相比,SB 203580进一步抑制了p38的磷酸化水平,进一步抑制了Collagen-III,Collagen-I和α-SMA的表达水平。结论1、SB 203580改善过表达LOXL2成纤维细胞胶原蛋白沉积和线粒体功能损害;2、LOXL2抑制剂减轻D-半乳糖诱导成纤维细胞衰老,细胞外胶原蛋白沉积和线粒体功能损害;3、联合应用SB 203580和LOXL2抑制剂进一步缓解D-半乳糖诱导成纤维细胞胶原沉积水平;4、LOXL2通过TGF-β1/p38 MAPK通路介导成纤维细胞胶原沉积和促纤维化蛋白表达参与骨骼肌纤维化调控。第四部分LOXL2抑制剂改善D-半乳糖诱导C57BL/6J小鼠骨骼肌结构和功能的损害目的探讨施用选择性LOXL2抑制剂对D-半乳糖诱导亚急性衰老小鼠骨骼肌结构和功能的作用,为LOXL2抑制剂治疗肌肉减少症提供动物研究基础。方法对50只8周龄雄性C57BL/6J小鼠进行为期一周的适应性喂养后进行随机分组。根据是否注射D-半乳糖（200 mg/kg）首先分成对照组（12只）和D-半乳糖组（38只）。持续注射D-半乳糖8周后,根据注射D-半乳糖的同时是否注射选择性LOXL2抑制剂随机分成D-半乳糖组（12只）,低剂量抑制剂组（5 mg/kg,13只）和高剂量抑制剂组（10 mg/kg,13只）,再次注射8周,期间每隔一周检测体重及绝对抓力。最后一次注射后24小时,利用DEXA对麻醉后小鼠进行身体成份检测。根据骨骼肌功能和质量,筛选出符合肌肉减少症表现的小鼠。随后,各组随机选取3只小鼠,依据体重进行麻醉后灌注通用型组织固定液。固定后,分离小鼠双侧腓肠肌,蔗糖溶液梯度脱水后,进行石蜡包埋切片并对切片进行H＆E染色,天狼星红染色和LOXL2,Collagen-I免疫组化染色。其余小鼠麻醉后处死,收集小鼠血液离心后获取血清用于氧化应激标志性指标检测,冰上迅速分离小鼠双侧腓肠肌。用组织剪剪取约50 mg腓肠肌组织加入含有1%PMSF的RIPA裂解液中,利用低温组织研磨仪充分裂解后高速离心获得组织上清液。测定上清液蛋白浓度后,利用Western blotting检测GLB1,p53,P16INK4a,Collagen-III,Collagen-I,LOXL2,α-SMA,TGF-β1,p38和p-p38的蛋白表达水平。另从各组中随机取3块1×1 mm大小的骨骼肌样品,用2.5%戊二醛固定,用四氧化锇和乙酸双氧铀染色,切成约50 nm的厚度,进行透射电子显微镜观察。结果与对照组相比,持续16周的D-半乳糖注射引起C57BL/6J小鼠1、体重减轻;2、骨骼肌衰老相关蛋白GLB1,p53和P16INK4a蛋白表达水平升高;3、骨骼肌LOXL2蛋白表达水平升高;4、骨骼肌胶原沉积增加;5、骨骼肌纤维化相关蛋白Collagen-III,Collagen-I,α-SMA和TGF-β1表达水平升高,p-p38与p38比值显著升高;6、骨骼肌肌纤维横截面积减小;7、相对抓力减小;8、后肢瘦体重减少;9、骨骼肌氧化应激指标异常;10、骨骼肌内受损线粒体数量增加。与D-半乳糖组相比,持续8周的低剂量LOXL2抑制剂注射引起C57BL/6J小鼠1、骨骼肌衰老相关蛋白GLB1,p53和P16INK4a蛋白表达水平降低;2、骨骼肌LOXL2蛋白表达水平降低;3、骨骼肌胶原沉积减少;4、骨骼肌肌纤维横截面积增大;5、相对抓力增大。与D-半乳糖组相比,持续8周的高剂量LOXL2抑制剂注射引起C57BL/6J小鼠1、体重增加;2、骨骼肌衰老相关蛋白GLB1,p53和P16INK4a蛋白表达水平降低;3、骨骼肌LOXL2蛋白表达水平降低;4、骨骼肌胶原沉积减少;5、骨骼肌纤维化相关蛋白Collagen-III,Collagen-I,α-SMA和TGF-β1表达水平降低,p-p38与p38比值显著降低;6、骨骼肌肌纤维横截面积增大;7、相对抓力增大;8、后肢瘦体重增加;9、骨骼肌氧化应激指标改善;10、骨骼肌内受损线粒体数量减少。结论1、D-半乳糖注射引起小鼠衰老,体重减轻,骨骼肌萎缩,骨骼肌纤维化和线粒体损害。2、高剂量LOXL2有效延缓小鼠衰老,减轻骨骼肌萎缩和骨骼肌纤维化并减轻氧化应激和线粒体损害。