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植物特殊代谢产物在植物应对生物和非生物胁迫中起到重要的作用。其中挥发性萜烯化合物（terpenoids volatile organic compouns）在植物生长发育及与外界环境相互作用中起到重要的作用。挥发性萜烯化合物主要由异戊二烯（C5）、单萜（C10）、倍半萜（C15）及其上述化合物的修饰衍生物组成。桑树是重要经济树种,但关于其挥发性萜烯化合物的研究在国内外还鲜有报道。同时,基于系统发生树演化分析结果表明来自不同植物催化产物相同的萜烯合酶序列分歧度往往大于来自同种植物催化产物不同的萜烯合酶。该现象暗示植物萜烯合酶发生了多次收敛演化。截至目前,植物挥发性萜烯化合物已经有了大量的研究,然而关于萜烯合酶收敛演化方面的研究仍知之甚少。本研究以川桑（Morus notabilis）的为实验材料,首先分析了桑树组成型挥发性萜烯化合物,进一步通过生物胁迫和激素处理,获得了诱导型挥发性萜烯化合物的信息。通过生物信息学筛选、qRT-PCR和体外酶活测定等研究手段确定了负责桑树根和叶挥发性萜烯化合物合成的萜烯合酶;结合遗传学、生物信息学、生物化学和计算化学研究方法解析了（E）-β-罗勒烯（（E）-β-ocimene）合酶的演化历史并鉴定得到与（E）-β-罗勒烯合酶收敛演化密切相关的氨基酸残基。主要研究内容及结果如下:1.桑树根和叶中挥发性萜烯化合物分析利用固相微萃取串联GC/MS（SPME-GC/MS）的研究手段对川桑根和叶顶空挥发物质进行收集并检测,结果显示只有α-蒎烯（α-pinene）一种组成型挥发性萜烯化合物。经过茉莉酸甲酯（methyljasmonate,MeJA）处理后,桑叶会释放大量诱导型挥发性萜烯化合物（E）-β-罗勒烯和芳樟醇（linalool）。根的诱导型挥发性萜烯化合物由多种单萜化合物组成,以1,8-桉树脑（1,8-cineole）为主。川桑叶被家蚕咬食后的挥发性萜烯化合物与MeJA处理的挥发性萜烯化合物在组成上无显著性差异。2.桑树萜烯合酶基因的鉴定及序列分析用已知的萜烯合酶作为问询序列对桑树基因编码区域（coding DNA sequence,CDS）数据库进行Blast检索分析,共鉴定得到26个萜烯合酶,系统发生树演化分析将其归为6个基因家族。qRT-PCR结果显示,MeJA处理能够诱导桑树叶中萜烯合酶基因的表达上调,包括MnTPS11、MnTPS12、MnTPS18和MnTPS25。在根中,基因MnTPS11、MnTPS13、MnTPS18和MnTPS25经MeJA处理后亦上调表达。原生质体亚细胞定位结果显示MnTPS11、MnTPS12、MnTPS13、MnTPS18和MnTPS25均定位于叶绿体。3.桑树萜烯合酶 MnTPS11、MnTPS12、MnTPS13、MnTPS18 和 MnTPS25 体外表达及产物分析利用大肠杆菌系统成功表达MnTPS11、MnTPS12、MnTPS13、MnTPS18、MnTPS25与His-tag的重组蛋白,经亲和纯化的萜烯合酶蛋白质与单萜化合物前体香叶酯焦磷酸（geranyl diphosphate,GPP）孵育。之后,使用SPME-GC/MS方法检测其反应产物,结果显示MnTPS12以（E）-β-罗勒烯为主要产物同时生成微量的副产物（Z）-β-罗勒烯（（Z）-β-ocimene）;MnTPS13能够以GPP为底物产生6个产物,分别是 α-侧柏烯（α-thujene）、α-蒎烯（α-pinene）、香松烯（sabinene）、β-蒎烯（β-pinene）、1,8-桉树脑和γ-松油烯（γ-terpinene）;MnTPS18和MnTPS25的催化产物均为芳樟醇。4.（E）-β-罗勒烯合酶系统发生树演化分析与基因组微共线性分析通过结合被子植物萜烯合酶氨基酸序列的系统发生树演化分析和萜烯合酶所在基因组区域的微共线性分析,表明（E）-β-罗勒烯合酶在被子植物演化过程中发生了多次收敛演化。最早的趋异演化事件发生时间早于双子叶植物大规模辐射演化,而晚于单、双子叶植物分化。5.与（E）-β-罗勒烯合酶功能密切相关的氨基酸残基的鉴定通过对祖先基因氨基酸序列进行多序列比对,鉴定到63个与（E）-β-罗勒烯合酶活性密切相关的候选位点。以模拟的单萜合酶-GPP复合物的结构信息为依据计算单萜合酶中与底物距离范围小于10A的氨基酸残基,最终在上述鉴定到的63个位点中锁定了其中6个氨基酸残基。进一步通过点突变结合酶活实验分析证明,其中4个氨基酸残基（N388I-Y420F-I446S-L485F）的突变可以将不同的单萜合酶完全转变成β-罗勒烯合酶。6.单萜合酶通过改变中间体的构象获得合成（E/Z）-β-罗勒烯的活性通过将SCS、以及双点突变体SCSY420F/I446S和四点突变体SC SN338I/Y420F/I446S/L485F与橙花基焦磷酸（neryl diphosphate,NPP）进行孵育检测其产物,结果表明点突变的SCS阻碍了 GPP的异构化,从而获得新的催化活性。QM/MMMD模拟表明,突变的SCS改变了中间体沉香基焦磷酸（linalyl diphosphate,LPP）的构象。整合点突变实验数据进行分析,可得出以下结论:残基位点Y420、1446和酶活中心的水结合参与构筑环状单萜合酶催化腔。环状产物的单萜合酶通过预构效应有利于中间体LPP形成环状产物的构象,当Y420F突变后,苯丙氨酸残基无法与水分子形成氢键,并且残基的疏水性导致水分子很难进入催化腔,而I446S的突变则加剧了催化腔对中间体构象的限制能力的丧失,LPP的构象不再利于形成环状产物中间体。双突变N338I/L485F在此基础上进一步改变了中间体的构象,有利于（E）-β-罗勒烯的生成。本论文首次对桑树挥发性萜烯化合物以及萜烯合酶进行了研究,为环境友好型育种研究奠定了基础。同时,本研究为被子植物单萜合酶的演化提供了新的见解,系统的解析了（E）-β-罗勒烯合酶收敛演化现象以及分子机理,为萜烯合酶的人工设计提供新的重要靶位点。