目的胰腺癌是一种主要来源于胰腺导管细胞的恶性实体肿瘤。近年来胰腺癌发病率在国内外均呈稳固上升趋势,每10年增加15%左右。胰腺癌是目前预后最差的消化系统肿瘤,五年生存率仅4%。尽管外科手术和化疗有很大的改进,但近20年来胰腺癌患者的预后并未有明显改善。目前多项研究表明,缺氧是实体瘤中存在的一种普遍现象,其作为应激原,可激活肿瘤细胞内的一系列基因对乏氧作出应答反应,从而改变肿瘤生物学行为,如细胞增殖、细胞凋亡抑制、肿瘤血管形成、能量代谢及侵袭转移等,使肿瘤适应乏氧微环境,增加了临床治疗的困难。胰腺癌是一个典型的乏氧实体肿瘤,胰腺癌患者的CT检查常表现为肿瘤性占位性病变的中心有缺血坏死低密度灶,并且在增强扫描时肿瘤坏死病灶无增强,提示肿瘤内缺乏有效血管,处于缺氧状态。因此,乏氧状态下,对其相关基因调控机制的研究,可能为胰腺癌有效治疗提供新的思路。在众多参与细胞乏氧状态调控的转录因子中研究最深入的、作用最强的当属乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF),其能特异性地结合于一种低氧反应元件(hypoxia-responsive element, HRE)(5’-RCGTG-3’)调节其靶基因的转录活性,改变肿瘤细胞的生物学行为。有研究表明,低氧微环境可以诱导SCF的表达,SCF是一种干细胞因子,表达于多种肿瘤细胞的表面,在肿瘤细胞增殖、血管新生等方面有重要作用。因此,我们推测胰腺癌细胞在乏氧环境下可通过HIF调节SCF的表达,参与肿瘤的发生、发展过程。通过相关的实验技术初步观察胰腺癌组织中HIF-1与SCF表达相关性,验证乏氧环境下HIF-1与SCF之间的相互调节关系及转录调控机制。方法一、胰腺癌组织中SCF与HIF-1的表达情况1.利用免疫组化方法检测SCF、HIF-1在胰腺组织中的表达,初步分析SCF与HIF-1的表达相关性。二、胰腺癌细胞中HIF-1α、c-kit的基础表达情况1.本研究选择胰腺癌细胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、PANC-1、Capan-1为研究对象。采用流式细胞技术分析不同胰腺癌细胞中c-kit (CD117)的表达,为下一步实验选择合适的细胞系。2.静息状态下,提取胰腺癌细胞蛋白,应用Western blot方法检测不同胰腺癌细胞中HIF-1α蛋白的基础表达情况；三、明确乏氧状态下胰腺癌细胞中HIF-1与SCF表达水平及调节关系1.实验选择胰腺癌细胞系BxPC-3、PANC-1为研究对象,采用1%O2、5％CO2、94%N2混合气体对密闭培养箱中细胞进行不同时间乏氧培养。2.应用细胞转染和小RNA干扰技术下调HIF-1α的表达后,分别应用Western blot和RT-PCR检测不同处理条件下胰腺癌细胞中SCF、HIF-1α、 VEGF及内参β-actin蛋白和基因的表达情况。四、研究乏氧状态下HIF-1与SCF的相互作用形式以及转录调控机制1.采用染色体免疫共沉淀技术(ChIP)明确HIF-1对SCF的调控形式。2.应用HIF-1过表达载体、SCF基因启动子或突变的SCF基因启动子荧光素酶表达载体,共同转染胰腺癌细胞,采用双荧光素酶分析法,定量检测HIF-1调控SCF基因转录激活的能力。结果HIF-1和SCF在胰腺癌组织中的表达均明显高于正常胰腺组织,且两者呈正相关。流式细胞技术结果显示BxPC-3、PANC-1高表达c-kit,结合western blot结果选择BxPC-3、PANC-1作为体外实验研究对象；经过不同时间的乏氧处理后,HIF-1与SCF蛋白在低氧环境下表达增加,并呈现同步性。通过RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子-1(HIF-1)的表达后,western blot及RT-PCR结果显示,可以同时抑制SCF的InRNA与蛋白表达,而对照组没有抑制效果；进一步的研究发现,HIF-1可以直接结合于SCF基因启动子区的乏氧反应原件(HRE),并且可以上调SCF启动子的转录活性。结论乏氧环境下HIF-1是调节SCF表达的关键转录因子；SCF是促进胰腺癌生长和侵袭的重要细胞因子,HIF-1和SCF/c-kit信号通路可能成为治疗胰腺癌的潜在靶点,为临床上有效的治疗胰腺癌提供新的思路。