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研究背景食管癌诱因之一是亚硝胺,亚硝胺通过形成烷化剂而使核酸甲基化,特别是DNA的鸟嘌呤的N7位发生甲基化,因而使DNA产生损伤,最终导致肿瘤形成。肿瘤发生过程中存在表观遗传修饰的改变,但亚硝胺诱导过程中是否导致表观遗传修饰改变还不清楚。肿瘤发生过程中存在甲基化模式的混乱,通常导致癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化,我们前期研究发现亚硝胺诱导进程中存在早期基因组DNA甲基化水平的降低,随诱导时间延长基因表达升高。因此,我们想探讨亚硝胺是通过DNA甲基化还是组蛋白乙酰化途径使基因大量表达,以及目前发现的脱甲基相关的蛋白Gadd45α是否参与了亚硝胺诱导进程中甲基化水平降低。研究目的探索亚硝胺诱癌是通过DNA甲基化还是组蛋白乙酰化途径,以及Gadd45α是否参与了亚硝胺诱导进程中甲基化水平降低。研究方法:1、用亚硝胺化合物灌喂小鼠,诱导食管癌变,病理切片和电镜检测分析诱导进程中食管各层病变的特点。2、亚硝胺诱导的4周、8周、20周,基因芯片分析食管组织的基因差异表达情况,筛选并分析了DNA甲基化还是组蛋白乙酰化相关基因的变化特点。3、在诱导早期1周～4周用RT-PCR和免疫组化技术分别检测分析了Gadd45α在mRNA和蛋白水平的变化趋势。研究结果1、证实了亚硝胺对食管粘膜的损伤作用,亚硝胺诱导可使粘膜上皮异常增生,且时间依赖性特征显著。2、基因芯片分析表观遗传修饰相关基因,结果未筛选出明显改变的组蛋白乙酰化酶基因,7种组蛋白脱乙酰酶相关基因在诱导后呈现上调趋势。甲基化酶Dnmt1、Dnmt2在诱导8周和20周,分别升高5.65、6.80和2.11、4.15;去甲基蛋白Mbd2在诱导8周和20周分别升高2.29、4.00,Gadd45α在诱导4周、8周和20周分别升高2.91、56.70、65.47。3、基因芯片分析癌基因和抑癌基因,136个癌基因中,其中4周上调表达的26个,8周上调表达的97个,20周上调表达的130个。仅发现5个抑癌基因在8周～20周表达轻微上调。4、Gadd45αmRNA检测发现在对照组和实验组样本中均可以检测出Gadd45α的mRNA表达。在诱导1周～4周时,实验组Gadd45α表达量略高于对照组。5、Gadd45α蛋白水平检测发现:Gadd45α主要表达于粘膜层细胞核中,对照组和实验组的数据表明诱导第2周开始Gadd45α表达出现差异,实验组Gadd45α表达强度明显高于对照组。6、1周~4周亚硝胺诱导基因组甲基化水平的迅速降低;4周开始基因组表达迅速上升;30周开始发生明确的形态学改变。主要结论1、亚硝胺诱导主要导致癌基因表达上调。2、组蛋白乙酰化酶未参与亚硝胺诱导基因表达上调,基因组表达升高可能是通过DNA甲基化调控实现的。3、Gadd45α在亚硝胺诱导1周～4周的少量升高可能与早期的DNA甲基化降低有关, 8周～20周Gadd45α的大量表达可能与亚硝胺诱导过程的DNA损伤修复有关。4、亚硝胺诱导过程中遵循DNA甲基化水平降低→基因组表达水平显著升高→发生组织形态学改变的时空顺序,这种动态特点为亚硝胺诱导肿瘤形成过程中的表观遗传修饰改变和肿瘤形成之间的因果关系提供了新的实验证据,也为研究亚硝胺诱导食管癌变早期进程中表观遗传修饰和癌变进程中的调控机理提供新的线索。