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布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患传染病,该病在世界各国均有发生,我国也流行严重。该病在家畜中以流产为主要症状,在人上则出现波状热、关节炎和心内膜炎等症状。目前存在几种动物布鲁氏菌疫苗,如猪布鲁氏菌2号减毒疫苗、牛布鲁氏菌A19减毒疫苗等,在我国也被广泛应用,对预防牛布鲁氏菌病起到了重要的作用。然而它们普遍存在对动物的保护率较低、对免疫人员的毒力较高、缺乏鉴别诊断标记不能进行辨别免疫动物和野毒感染动物等缺点。近年来,科研人员进行了大量的研究,在原来疫苗的基础上开发了多种基因缺失疫苗。目前在A19疫苗基础上缺失VirB12基因的A19-ΔVirB12基因缺失疫苗已经进入新兽药审批阶段,有望近期获批并推广应用,这将带来在该苗免疫畜群检测VirB12抗体,以检测野毒感染的巨大需求。然而现在还没有相应的检测方法得到应用,本研究旨在建立基于VirB12抗原的鉴别检测方法。为获得高纯度易纯化的布鲁氏菌VirB12蛋白抗原,根据Gen Bank中的VirB12的基因序列设计引物并进行扩增,扩增产物连接p BIC质粒后转化到短小芽孢杆菌中,得到了VirB12蛋白的分泌型表达菌。诱导后对其进行了PAGE和Western Blotting鉴定。结果表明成功构建了VirB12的分泌表达菌株,诱导后在培养上清中大量表达,蛋白含量高达80%,其能与布鲁氏菌标准阳性血清、6×His单克隆抗体发生反应,与A19-ΔVirB12菌株免疫血清不发生反应。为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化,将高纯度的VirB12重组蛋白包被ELISA板,对其进行条件优化后初步建立了检测布鲁氏菌抗体的ELISA方法。研究结果表明,两步法纯化的VirB12重组蛋白的效果很好,VirB12重组蛋白的纯度可至98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最适包被浓度为1mg·m L-1,最适封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST溶液,血清最适稀释浓度为1:25,酶标抗体的最佳稀释浓度为1:1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%。为分析VirB12蛋白的特异性抗原表位,发挥特异多肽易合成纯度高的优点,进行了VirB12多肽ELISA的研究。根据VirB12基因序列设计并合成了10条多肽。将合成的10条多肽分别作为抗原,通过dot-blotting实验进行初步筛选,再经过ELISA实验验证,最终确定了有反应原性的两条多肽P07和P08号多肽。将P07和P08这两条多肽进行生物素标记,分别将其作为抗原,与亲和素包被的酶标板进行ELISA实验,发现P07B多肽比P08B多肽的反应原性好。将P07B多肽作为抗原进行条件优化后,初步确立了检测布鲁氏菌抗体的ELISA试验方法。在建立的ELISA中,亲和素的最佳包被浓度为10mg·m L-1,P07B多肽的最佳包被浓度为1mg·m L-1,最佳封闭液为含10%猪血清的PBST溶液,血清最适稀释浓度为1:100,酶标抗体的最佳稀释浓度为1:3000。对19份阳性血清及13份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到87.5%。上述实验的结果表明,本试验建立的以分泌表达纯化的VirB12和P07B多肽为抗原的ELISA方法可以检测布鲁氏菌感染抗体,能从A19-ΔVirB12免疫畜群检出野毒感染,有望研制成检测试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。