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背景心理应激(psychological stress，PS)是指机体在受到某种环境刺激作用时引起的心理及生理机能改变的过程，是由于客观要求和应付能力不平衡所产生的一种适应环境的紧张反应状态。伴随社会的快速发展及各方面压力的激增，社会的精神心理因素引起的应激在人类健康方面的影响越来越多。诸多研究证实，应激虽不像生物或理化因素可以导致特定的疾病，却可以非特异性的方式导致机体损害，如诱发冠心病、高血压、消化性溃疡、神经精神疾病等疾病的发生等。锌作为人体的必需微量元素之一，在机体众多生物反应中均发挥重要作用，同时它又具有各类生物功能。一些锌代谢相关功能蛋白在锌稳态的维持中发挥重要的作用，包括金属硫蛋白(metallothionein, MT)和两类跨膜转运体，后者包括锌转运体(zinctransportors，ZnT)家族和锌铁调控蛋白(zrt,irt-like protein, ZIP)。细胞锌稳态容易受到胞外各种病理生理环境因素的影响，如炎症，氧化应激等，实验证明，在应激条件下，胞内游离锌离子浓度可显著上升，进而导致细胞损伤[1-2]。既往研究也发现热环境、加速度刺激、噪声等均可导致血清锌水平显著下降[3-4]。结合上述研究，我们推测微量元素锌在应激过程中可能具有重要作用。一方面，各种应激导致胞内游离锌浓度上升，使锌在胞内产生毒性作用，造成细胞损伤；另一方面，应激导致机体血清锌下降，并可能导致体内锌的重新分布，从而影响体内的抗氧化能力等，进而影响机体的抗应激能力。因此，了解心理应激过程中机体锌代谢的变化特点及其可能机制，有助于为研究解决应激诱发损伤提供线索。实验目的本研究拟通过观察心理应激对大鼠锌代谢，尤其是海马锌水平变化的规律，并对上述变化的可能机制进行探讨，不仅有助于了解心理应激过程中锌代谢的变化特点及其机制，而且在此基础上为心理应激相关疾病的进一步研究提供实验依据和理论参考。实验方法1.动物分组及喂养健康雄性SD大鼠，体重180-200g，适应喂养3-5天后按体重随机分为4组，每组分为两小组：正常对照7天组、心理应激7天组；正常对照14天组、心理应激14天组；心理应激14天脱应激7天组，相应对照组；心理应激14天脱应激14天组，相应对照组。每小组15只大鼠。2.心理应激动物模型的建立通过Communication Box System制作大鼠心理应激模型。放免试剂盒测定血清皮质酮(CORT)含量。3.大鼠各组织锌和血清锌含量的测定采用原子吸收分光光度计火焰法测定。1g/L锌标准贮备液由国家标准物质中心提供。4.大鼠锌表观吸收率的计算锌表观吸收率=(膳食锌含量—粪便锌含量)/膳食锌含量×100%。5.大鼠肝脏ZIP14和海马ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表达量的测定采用实时定量荧光PCR法测定大鼠肝脏ZIP14和海马ZnT1、ZnT3和ZIP1mRNA表达水平。6.大鼠肝脏和海马MT蛋白含量的测定ELISA法测定大鼠肝和海马MT蛋白含量。7.大鼠海马组织内游离锌离子的测定TSQ荧光染色法测定大鼠海马组织冰冻切片游离锌离子的含量。8.检测大鼠心理应激后行为学的变化。利用自发活动和强迫游泳实验检测大鼠行为学指标。9.统计方法使用统计软件SPSS16.0进行统计分析，利用Excel2007进行数据汇总及绘图，检验水准α=0.05；采用两样本t检验和one-wayANVOA进行比较。实验结果1.心理应激对大鼠血清CORT含量的影响心理应激7天和14天组大鼠血清CORT含量较对照组明显升高(P<0.05)。脱应激7天和14天后大鼠血清CORT含量恢复至正常水平，与相应对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。2.心理应激对大鼠体增重的影响实验组大鼠与空白对照组大鼠的体增重相比，差异无统计学意义(P>0.05)3.心理应激对大鼠锌吸收的影响心理应激7天组和14天组与相应对照组的鼠粮摄入量相比无明显差异(P>0.05)，说明各组大鼠锌摄入量均无明显差异。而心理应激7天后大鼠粪锌排出量有所增加但无统计学意义(P>0.05)，心理应激14天后大鼠粪锌排出量增加，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。心理应激7天组和14天组与相应对照组相比锌表观吸收率均下降(P<0.05)，脱应激7天和14天后，大鼠锌表观吸收率恢复至正常水平，与相应对照组相比无明显差异(P>0.05)。4.心理应激对大鼠血清和组织锌含量的影响4.1.心理应激对大鼠血清锌含量的影响实验结果显示，与对照组相比，连续心理应激7天和14天后，大鼠血清锌含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。脱应激7天和14天后，大鼠血清锌含量恢复至正常水平，与相应对照组差异无统计学意义(P>0.05)。4.2.心理应激对大鼠各组织锌含量的影响4.2.1.心理应激对大鼠心、肝、脾、肾和小肠锌含量的影响与空白对照组相比，大鼠心、脾、肾和肠锌含量在连续7天和14天心理应激后无变化，大鼠肝锌含量在连续心理应激7天后无显著变化，但大鼠肝锌含量在连续应激14天后显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。脱应激7天和14天后肝锌含量恢复至正常水平，与相应对照组无统计学差异(P>0.05)。4.2.2.心理应激对大鼠各脑区锌含量的影响与空白对照组相比，在连续7天和14天心理应激后，大鼠小脑、皮层锌含量无变化，连续心理应激7天及14天后海马锌含量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。脱应激7天和14天后，海马血清锌含量恢复至正常水平，与相应对照组无统计学差异(P>0.05)。5.心理应激对大鼠肝组织MT蛋白含量的影响心理应激7天后大鼠肝MT蛋白含量上升，但差异无统计学意义(P>0.05)。心理应激14天后，与对照组相比，大鼠肝组织内MT蛋白含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。脱应激7天和14天后大鼠肝组织MT蛋白含量恢复至正常水平，与相应对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。6.心理应激对大鼠肝组织ZIP14mRNA水平的影响与空白对照组相比，7天应激组大鼠肝ZIP14mRNA表达水平上升，差异有统计学意义(P<0.05)，14天应激组大鼠肝组织ZIP14mRNA水平无显著变化(P>0.05)。7.心理应激对大鼠海马ZnT3、ZnT1和ZIP1mRNA水平的影响荧光实时定量PCR实验结果显示，与空白对照组比较，心理应激7天组和14天组大鼠海马内ZnT3和ZnT1mRNA水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。脱应激7天和14天后恢复至正常水平，与相应对照组大鼠相比，差异无统计学意义(P>0.05)。心理应激7天组大鼠海马组织内ZIP1mRNA水平下降差异有统计学差异(P<0.05)，14天组大鼠水平恢复至正常水平，脱应激7天和14后大鼠恢复至正常水平，与相应对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。8.心理应激对大鼠海马MT蛋白含量的影响与空白对照组比较，心理应激7天和14天组大鼠海马组织内MT蛋白含量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。脱应激7天和14天后，与相应对照组相比，海马内MT蛋白含量恢复至正常水平，差异无统计学意义(P>0.05)。9.心理应激对大鼠海马内游离锌离子的影响TSQ荧光染色结果显示，心理应激组海马的荧光染色程度明显高于对照组。10.心理应激对大鼠在强迫游泳与自发活动实验中行为的影响连续心理应激7天和14天后的大鼠在强迫游泳实验中不动的时间明显长于相应的空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组大鼠相比，连续心理应激7天和14天后，大鼠在自发活动箱内行进的总路程明显更短，休息时间更长，速度更慢，且以上差异均有统计学意义(P<0.05)结论本实验利用Communication Box成功建立了心理应激动物模型，通过对在心理应激情况下大鼠的锌代谢变化的观察，同时利用荧光实时定量PCR和ELISA观察了心理应激对与锌代谢密切相关的主要分子的表达变化，并进一步观察PS对大鼠行为学的影响。主要结论如下：1．心理应激引起大鼠锌表观吸收率的下降，这与心理应激导致大鼠粪锌排出量增加相关。2．心理应激导致大鼠血清锌含量下降，这与大鼠锌表观吸收率下降以及肝锌蓄积相关，肝锌蓄积与MT以及锌转运体ZIP14表达升高相关。3．心理应激可导致海马锌含量下降，可能受到海马内锌稳态相关调节分子MT、ZnT1、ZnT3和ZIP1的表达下降的影响。4．心理应激后大鼠行为学发生了变化，可能与心理应激导致的大鼠海马锌含量下降以及游离锌离子上升影响了海马功能有关。