目的前期研究表明海马蛋白激酶Mζ(protein kinase Mζ,PKMζ)参与以肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)为典型代表的慢性功能性内脏痛大鼠中枢敏化,本研究将探究海马N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide sensitive factor,NSF)是否作为PKMζ信号通路下游的转运蛋白参与慢性功能性内脏痛大鼠中枢敏化的形成,为IBS慢性功能性内脏痛的临床防治提供新思路。方法(1)建立IBS模型大鼠:新生SD乳鼠在出生第3-21天,每天固定时间给予3小时的母婴分离,即母鼠和乳鼠不同笼、不同室。对照组乳鼠不做任何处理,正常饲养。待大鼠长至8周成年后,通过检测大鼠腹外斜肌对40mm Hg和60mm Hg结直肠扩张引起的放电反应来评估大鼠的内脏痛觉敏感性。(2)Western blot方法检测大鼠海马NSF的表达水平。(3)采用免疫组化的方法检测大鼠NSF在海马CA1区的表达情况。(4)大鼠行海马脑立体定位置管,海马双侧微量注射不同剂量的NSF的特异性抑制剂pep2m(100μM、200μM、400μM,每侧2μl),比较给药前后腹外斜肌放电反应的差异。(5)用含有NSF抑制剂pep2m(100μM)的人工脑脊液灌流脑片60min,随后取海马组织,通过Western blot方法检测PKMζ信号通路下游AMPARs亚型Glu R2的表达水平是否发生变化。(6)用含有PKMζ抑制剂ZIP(2.5μM)的人工脑脊液灌流脑片30min,随后取海马组织,通过Western blot方法检测PKMζ信号通路下游NSF的表达水平是否发生变化。结果(1)IBS模型大鼠内脏痛觉敏感性较正常大鼠显著增高(p<0.05)。(2)与正常大鼠相比较,IBS模型大鼠海马NSF表达量显著增高(p<0.05)。(3)免疫组化结果显示正常大鼠和IBS模型大鼠海马CA1区中均可见NSF在中小神经元细胞和神经胶质细胞的细胞膜和细胞质上表达。(4)海马双侧微量注射pep2m可剂量依赖性抑制IBS模型大鼠内脏痛觉敏感性(p<0.05)。(5)用含有pep2m的人工脑脊液灌流脑片后,IBS模型大鼠海马Glu R2表达水平显著下降(p<0.05),而正常大鼠给药前后海马Glu R2表达水平未发生明显变化。(6)用含有ZIP的人工脑脊液灌流脑片后,IBS模型大鼠海马NSF表达水平显著下降(p<0.05),而正常大鼠给药前后海马NSF表达水平未发生明显变化。结论新生乳鼠给予母婴分离应激可导致其成年后内脏痛觉敏化。其机制可能是海马PKMζ磷酸化后通过NSF/Glu R2作用增加AMPARs的效应进而最终导致慢性功能性内脏痛觉敏化。