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目的:脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stromal cells,ADSCs)的多向分化潜能决定了其广泛应用于组织工程和再生医学领域,也常作为药理学研究的重要模型细胞。然而,已发现ADSCs在传统的二维体外扩增过程中会损失一定程度的干细胞特性。有研究提示这种性能的缺失可能与二维培养环境有关,模拟体内三维环境或许是维持干细胞特性的有效方法。因此,本课题的研究目的是采用3D打印技术制作微孔板构建三维培养条件,探究不同培养维度及其变化对ADSCs干性和分化功能的影响。方法:(1)采用3D打印技术制备微孔矩阵模具并利用模具构建琼脂糖微孔板,观察人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、人肝星状细胞株LX-2、人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast,HSF)、ADSCs等多种细胞在该微孔板下的成球效果。(2)通过在不同时间点测量细胞球直径,观察不同条件(细胞密度、消化纯化与否、不同分化诱导等)下ADSCs在微孔板上对细胞成球的影响。(3)流式细胞术检测微孔板3D细胞球(P0和P1代)表面标志物相对2D贴壁培养的表达情况;钙黄绿素-AM/PI活死细胞染色观察ADSCs球存活情况。(4)确定不同培养维度的转变对ADSCs生物学特性的影响:将ADSCs原代分离后一部分进行传统的2D贴壁培养,另一部分进行3D微孔板球形培养;培养6天后,部分2D培养转3D微孔板培养,部分3D转2D贴壁培养,剩余2D组和3D组分别消化后按原培养维度继续培养。共计2D-2D、3D-2D、2D-3D及3D-3D四组继续培养6天进行后续实验。平板克隆实验检测各组细胞自我增殖能力;免疫荧光方法检测干细胞多能转录因子(Nanog、Oct4、Sox-2)的表达情况;尼罗红染色、茜素红染色、及免疫荧光验证其成脂、成骨、成神经元分化潜能,RT-qPCR进一步验证其成脂标记基因PPAR-γ、成骨标记基因Osteocalcin及神经元标记基因Tubb3在mRNA水平的变化。结果:(1)利用3D打印技术构建微孔矩阵模具,并成功使琼脂糖表面图案化,得到琼脂糖微模板;HUVECs、LX-2、HSF、ADSCs等多种细胞均可在24-48h内通过细胞沉降和自聚集在琼脂糖微模板上形成大小均一,产量稳定球状体。(2)随着培养天数的增加,ADSCs细胞球直径会逐渐缩小,新增殖细胞不会黏附在原先球体上,而是以单细胞状散布微孔底部。无论是原代ADSCs,还是纯化后的干细胞中,其球体直径均会随培养时间的增加变小。并且在多向诱导培养进程中,也存在这种现象。(3)流式结果显示微孔板3D球形培养下的P1代ADSCs表达干细胞标志物率CD90阳性率由41.39%提升至64.19%,阴性标记物CD45由2.69%降低至0.92%;活死染色结果显示ADSCs球球体呈绿色荧光,内部区域呈微量红色荧光。(4)细胞平板克隆结果显示经3D-2D培养后的ADSCs自我克隆能力显著强于其余三组,2D-2D组与3D-3D组两组间无明显差异,3D-3D组比2D-3D强(P﹤0.01)。免疫荧光结果显示ADSCs 3D-3D组的三种干性转录因子(Nanog、Sox-2、Oct4)表达最强,2D-3D组表达高于3D-2D,3D-2D高于2D-2D组。尼罗红染色、茜素红染色及免疫荧光结果显示与常规2D贴壁培养相比,经三维培养和消化传代后ADSCs仍然具备多向分化(成脂、成骨及成神经元)诱导潜能。茜素红染色与成骨基因Osteocalcin RT-qPCR结果显示成骨诱导3D-3D组分化潜能高于3D-2D、2D-3D二组(P﹤0.05),而3D-2D、2D-3D二组显著性高于2D-2D组(P﹤0.01);免疫荧光与成神经元基因Tubb3 RT-qPCR结果显示3D-3D组高于其余三组,2D-3D高于2D-2D(P﹤0.01);在成脂诱导中,3D-2D组分化能力强于2D-2D组,表现为显著上调PPAR-γmRNA水平,增加细胞中的脂滴量。RT-qPCR结果显示3D-2D组高于3D-3D组,3D-3D组高于2D-2D组,2D-2D组高于2D-3D组(P﹤0.001)。结论:利用3D打印技术制备的琼脂糖微模板可成功培养多类型细胞球状体,这些细胞球大小均一,产量稳定。经此模具培养的ADSCs球状体直径同细胞密度正相关,但长期培养后无法以球体形态增殖;三维细胞球传代后可大幅度提高ADSCs球的阳性标志物的阳性率,从而达到纯化目的,但其纯化效果低于二维培养;ADSCs球大部分细胞存活,球体内侧少量细胞死亡。在2D-2D、3D-2D、2D-3D及3D-3D四种培养条件下,与持续二维培养(2D-2D)相比,当三维培养转为二维培养(3D-2D)能增加其增殖与成脂分化潜能;当3D转换为2D(3D-2D)其干性与分化潜能减弱,当二维培养转为三维培养(2D-3D)可一定程度增强其干性和分化能力,而持续三维培养条件下(3D-3D)可使ADSCs保持其最强干性与分化潜能。