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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是重要的人畜共患病病原菌，可引起多种动物全身性败血症或局部感染。Red重组系统具有抑制宿主外切核酸酶阻止外源线性DNA片段降解的能力，能够启动高效的双链断裂修复和瞬间重组，重组效率高，逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。β溶血素是嗜水气单胞菌主要的毒力基因之一。根据已发表的嗜水气单胞菌β溶血素基因的核甘酸序列，设计合成一对引物，以Ah J-1基因组DNA为摸板，通过PCR扩增得到β溶血素全基因序列，将该基因片段连接到pMD18-T载体中，构建克隆载体并测序。测序结果显示Ah J-1株β溶血素基因全长1588 bp，含有1482 bp的开放阅读框，编码493个氨基酸。将所获的Ah J-1株的β溶血素基因序列登录GenBank，序列号为DQ408263。序列分析发现与已发表的TPS30等多株嗜水气单胞菌的β溶血素基因100％同源，表明该基因较为保守。根据Ah J-1株β溶血素的基因序列设计一对引物，引物5’端有40 bp的拟敲除基因的同源臂，3’端20bp为扩增引物，以pKD4为模板，扩增两侧含FRT位点的卡那霉素抗性基因将氯霉素抗性的质粒pKD46电转化入目标菌Ah J-1，携带质粒pKD46的菌株Ah J-1，在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞，利用卡那霉素平板就可以筛选到阳性转化体。利用该重组系统，构建了β溶血素缺失的Ah J-1菌株，并检测了该缺失株对小鼠的毒力和生化特性，缺失株的LD50为2.3×109，只有一个生化特性发生改变。用Ah J-1β溶血素缺失株免疫健康小鼠，以未免疫小鼠为对照，用半定量RT-PCR的方法检测其细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的含量及mRNA的表达水平，扩增产物经电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相和扫描分析其相对表达量。结果显示RT-PCR产物经电泳后，分别检出IL-4、IL-6、IFN-γ、β-actin在180 bp、600bp、243 bp和348 bp处出现明显条带，表达量显著高于对照组，以5LD50 Ah J-1亲本株攻击，免疫保护力达到80％，PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的对应关系。Th1和Th2共同作用参与免疫保护。