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植物萜类化合物一直是人类药物的重要来源。大部分珍稀萜类在其原产植物中产量极低,直接从植物组织提取或通过化学半合成的方法来获取萜类化合物,不仅效率低、成本高,且易浪费自然资源,引起环境问题。合成生物学将工程学的思想与方法引入传统生物学研究中,强调通过对生物元件、模块和系统各层次的理性设计,构建能行使特定功能的新生命体。因此以容易遗传操作的微生物为底盘细胞,通过重构异源的萜类生物合成途径,结合前体供应及产物转运等功能模块的重新设计,可实现珍稀萜类化合物的大规模生产。本课题以大肠杆菌（E.coli）为底盘,从元件设计与挖掘,途经装配、底盘改造、产物转运、反应器规模的补料调控等方面,对萜类化合物的异源合成进行了研究。元件是合成生物学功能模块与系统设计的基础。本研究利用非线性映射能力很强的BP人工神经网络（Backpropagation artificial neural network, BP-ANN）算法建立了一种可精确预测调控元件强度的方法,为调控元件的人工理性设计奠定了基础。以E. coli Trc启动子和核糖体结合位点（Ribosomal binding site, RBS）表达调控元件为研究对象,通过随机突变,构建了强度呈梯度分布的100个调控元件,相对强度范围从O到3.559,并将其随机分为训练集和测试集两组。利用BP人工神经网络算法建立了可以精确预测调控元件强度的数学模型,将DNA序列与其调控强度进行了关联。在大量的随机模型中获得了模型NET9019576,其对训练集和测试集的拟合相关系数均达到0.98。以此为基础,设计并人工合成了16个具有不同预期强度的新调控元件。经实验证明,所合成的元件的调控强度很好地符合了预期值。所获得的人工设计元件,成功地应用于中国毒蝎（Buthus martensi Karsch）的小肽BmKI的表达,2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（MEP）萜类前体合成途径和白藜芦醇异源合成途径的精细调控。证明了元件人工理性设计的可行性和可靠性。除了人工理性设计,从自然界挖掘不同特性的元件,并加以利用也是获取元件的一个方式。MEP途径是原核生物中萜类化合物生物合成前体供应的主要途径,其在自然界中广泛分布,但不同原核生物中MEP途径合成元件在转录及酶活水平调控上呈现出多样性。本研究系统挖掘了芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、糖多胞菌属（Saccharopolyspora）和欧文氏菌属（Erwina）等不同原核生物的MEP途径生物合成元件,并尝试用于改善E. coli中的萜类化合物合成。以番茄红素和紫槐二烯的生物合成为例,研究表明,在大肠杆菌中引入阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）的dxs2基因（dxs2SAV）能够使四萜番茄红素和倍半萜紫槐二烯的产量分别比对照提高10.5倍和8.3倍,引入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的idi基因（idiBS）分别能使番茄红素和紫槐二烯的产量提高4.4和10.6倍。通过共表达dxs2SAV和idi BS,使两者的产量分别提高了16.5和15.5倍,达到20.57mg/L和331.90mg/L。该研究证明异源的MEP途径生物合成元件可以改善E. coli MEP途径的生物合成。如何从全基因组尺度对底盘细胞进行优化适配是萜类高效合成体系的构建重要方面。在前期的研究中,本实验室开发了全基因组尺度的代谢流量分布比较分析算法（Flux distribution comparison analysis, FDCA）,对并成功地预测了一系列潜在改造靶点。以番茄红素为研究对象,本研究系统地对其中的14个潜在强化靶点和11个潜在敲除靶点进行了实验验证,确证了4个新强化靶点（ompE, ompN, cmk, ndk）和5个新敲除靶点（eutD, deoB, yhfw, yahI, pta）能有效地提高萜类的合成。通过进一步集成最佳gdhA, eutD敲除靶点和ompE, ompN, tpiA强化靶点,使工程菌经摇瓶发酵后番茄红素产量比出发菌提高了174%。改造底盘细胞异源产物的外排系统可以减少毒性产物在胞内的积累,消除未知相互作用对菌体生长代谢、基因转录、酶活等产生不利影响。本研究以倍半萜紫槐二烯和二萜贝壳烯为研究对象,选取了革兰氏阴性菌中广泛存在的三组分多重耐药外排泵系统,如E. coli自身的AcrAB-TolC和MdtEF-TolC泵,以及来自于异源绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosd）的MexAB-OprM泵,通过对外排泵各组分单独过表达与组合强化,发现过表达外膜通道TolC组分能够使紫槐二烯和贝壳烯的产量分别增加33%和17%,比产率分别提高37%和26%。过表达异源内膜组分MexB能使紫槐二烯和贝壳烯的比产率比提高29%和70%。此外过表达内膜AcrB组分能够使菌体生长受到一定抑制,但比产率分别增加31%和10%。考虑到三组分外排泵系统是各组分按一定比例组成的精细的分子机器（如AcrA:AcrB:TolC=3:6:3）,为了使其效率最大化,进一步通过各组分组合强化及拷贝数调节,最终获得了最佳组合TolC-TolC-AcrB使紫槐二烯比产率提高了118%和AcrA-TolC-AcrB组合使贝壳烯提高了104%。根据菌株和过程的特性,建立合理的发酵控制策略是菌株潜力最大化的关键。传统蛋白高表达与小分子化合物异源合成这两个过程对菌体生长及基因表达强度具有完全不同的控制要求,因此传统成熟的适于蛋白高表达的E. coli高密度发酵工艺无法满足异源合成的需要。本研究以共表达dxs2SAV和idi BS的菌株为对象,首先建立了稳定期恒速补糖（6.05g/h）的发酵过程,发现发酵24h到72h是产物合成的快速积累阶段,通过稳定期不同糖流加速率的调控,使紫槐二烯产量由初始的2.5g/L提高到4.85g/L。考虑到72h后菌体衰老引起异源代谢活力下降,又采取了减慢对数期和延长菌体生长的策略,最终使紫槐二烯的产量达到6.1g/L。该研究结果为基于MEP途径的萜类合成工程菌构建及其发酵过程优化奠定了基础。