论文部分内容阅读
目的:本研究旨在从血清水平和细胞水平,探讨微小RNA(microRNA)在肝癌中的表达情况及其作用机制。血清水平上,具体研究miR-486-5p和miR-122-5p在肝癌中的表达情况,及与AFP联合诊断在肝癌中的诊断价值。细胞水平上,探索miR-486-5p对肝癌细胞增殖和迁移的作用,并深入研究miR-486-5p的作用靶标。方法:1.收集2016年6月-2017年3月解放军广州总医院检验科的60例肝癌患者血清标本,其中男性57例,女性3例,平均年龄53.9±11.2岁,同时收集肝炎患者30例、肝硬化患者30例、胃癌30例、乳腺癌30例、健康体检者30例作为对照组。通过RT-PCR检测各实验组和对照组中miR-486-5p和miR-122-5p的相对表达情况,并与AFP进行联合诊断,用ROC曲线说明血清学联合诊断的价值。2.用肝癌细胞SMMC-7721检测miR-486-5p的相对表达量,构建miR-486-5p过表达的SMMC7721肝癌稳定细胞株,通过CCK-8、细胞划痕和Transwell实验研究miR-486-5p对肝癌增殖和迁移的作用。3.通过TargetScan,miRanda,miRWalk和RNA22四个数据库,预测出22个miR-486-5p潜在的作用靶标,经qPCR和Western blot验证,确定CBL作为本课题的研究对象。用Western blot检测CBL在miR-486-5p过表达肝癌细胞中的表达,在miR-486-5p过表达的肝癌细胞中转染重组质粒,进而通过CCK-8、细胞划痕和Transwell实验探究CBL对肝癌细胞增殖和迁移的影响。结果:1.血清miR-486-5p和miR-122-5p在肝癌中的表达量低于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。肝癌组与胃癌组、乳腺癌组相比,表达量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.miR-486-5p和miR-122-5p与AFP血清表达水平的相关性分析,两者与AFP的表达均呈现负相关。3.miR-486-5p、miR-122-5p和AFP的联合诊断,单项检测HCC时,特异性最高的是miR-122-5p(95%),而敏感性最高的是AFP(73.7%)。双项检测HCC时,敏感性和特异性最高的分别是AFP+miR-486-5p,AFP+miR-122-5p(86%,90%)。三项的联合检测,敏感性和特异性分别是83.5%和90%,ROC曲线下面积AUC为0.891(95%CI:0.818-0.964),三项的联合检测高于单独检测。4.组织表达:用TCGA数据库共分析了422例样本,其中372例肝癌样本,50例癌旁样本。数据显示,与癌旁样本相比,miR-486-5p在肿瘤样本中的表达量明显下降,差异具有统计学意义(P<0.0001)。而对肿瘤大小、浸润程度、临床分期的分析,差异不具有统计学意义(P>0.05)。GSEA分析显示,有14条通路与miR-486-5p水平呈正相关,有4条通路与miR-486-5p水平呈负相关。根据GSEA数据分析,用聚类分析的方法将收集的样本可分为2个和3个亚型,在各亚型中检测miR-486-5p的表达水平。5.miR-486-5p在肝癌SMMC-7721细胞中低表达,构建miR-486-5p过表达的SMMC-7721细胞后,miR-486-5p的表达量明显增高,差异具有统计学意义(P<0.001)。miR-486-5p过表达的SMMC-7721细胞与空载相比,miR-486-5p过表达组能抑制肝癌细胞的增殖和迁移,具有统计学意义(P<0.05)。6.经qPCR和Western blot验证,miR-486-5p过表达抑制CBL的表达,过表达miR-486-5p的肝癌细胞共表达CBL重组质粒,肝癌细胞的增殖和迁移能力增强,具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.血清miR-486-5p和miR-122-5p可作为肝癌诊断的一个潜在生物学标志物,且两者与AFP的联合诊断可以提高肝癌诊断的价值。2.miR-486-5p在肝癌中低表达,能抑制肝癌细胞的增殖和迁移,CBL可能是miR-486-5p在肝癌发生发展过程中一个重要的靶标。