皮下预血管化对共微囊法异种胰岛移植影响的实验研究

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第一部分大鼠胰岛的分离、纯化、功能鉴定和微胶囊化目的:1,探讨大鼠胰岛分离和纯化的方法及乌司他丁对提高大鼠胰岛收获量的作用;2,研究大鼠胰岛的功能鉴定方法;3,制备海藻酸钠微胶囊大鼠胰岛。方法:1,随机选取20只SD雄性大鼠,按不同的胰岛分离,消化或纯化方法分为4组,每组5只。①A组:胆总管灌注胶原酶V+Ficoll纯化;②B组:胆总管灌注胶原酶V+手工纯化;③C组:胆总管灌注胶原酶V+乌司他丁5000U/L+Ficoll纯化;④D组:胆总管灌注胶原酶V+乌司他丁5000U/L+手工纯化;2,应用酶联免疫吸附测试法行大鼠胰岛素释放试验;3,高压静电场微胶囊成型装置制备海藻酸钠微胶囊大鼠胰岛。结果:1,A组和B组获得的胰岛大部分外膜较完整,部分边界不清;乌司他丁组(C组和D组)获得的胰岛外膜完整,边界平滑,结构致密。Ficoll纯化法(A组和C组)获得的胰岛细胞团较小、胰岛数量较少。而光镜下移液吸移管手工挑拣纯化法(B组和D组)纯化的胰岛不但外膜完整,边界平滑,结构致密,胰岛收获量多,而且含有较多较大的胰岛细胞团,胰岛纯度各组间无显著差异;2,大鼠胰岛素释放试验提示过夜培养的微胶囊胰岛功能优于裸露(无微胶囊)胰岛;3,高压静电场微胶囊成型装置制备的海藻酸钠微胶囊胰岛形态呈圆球形,直径约400μm,囊壁光滑,大小均匀,无拖尾现象。结论:1,消化过程中加入乌司他丁可提高胰岛的质量和数量,收获的胰岛数量多,外膜完整,边界平滑,结构致密。手工挑拣纯化法可提高胰岛收获量,但较费力和耗时;2,微胶囊对大鼠胰岛具有保护作用;3,高压静电场微胶囊成型装置制备的海藻酸钠微胶囊胰岛明显优于其他传统成囊方法。第二部分新型缓释bFGF微囊的制备和小鼠皮下预血管化研究目的:1,对海藻酸钙凝胶珠体系进行改进,构建新型bFGF缓释微囊;2,研究新型缓释bFGF微囊对受体小鼠皮下血管新生的作用。方法:1,应用高压静电场微胶囊成型装置在海藻酸钙凝胶珠形成过程中引入明胶,构建新型bFGF缓释微囊;2,选取C57BL/6雄性小鼠12只,随机分为4组,每组3只。①A组:小鼠背部皮下注射3μg新型bFGF微囊;②B组:小鼠背部皮下3μg bFGF一次性注射;③C组:空囊组;D组:小鼠背部皮下注射0.5ml生理盐水。结果:1,新型缓释bFGF微囊形态呈圆球形,直径约100μm,囊壁光滑,大小均匀,无拖尾;2,各组间新生血管数有非常显著差异(F=55.20,P<0.01),A组与其他各组相比较均有非常显著差异(P<0.01),B组与C组和D组相比较有显著差异(P<0.05)。结论:1,在钙离子存在的条件下,明胶与海藻酸钠交联形成凝胶,增强了海藻酸钙缓释效果,并通过静电聚合进一步加强海藻酸钙微囊的缓释效果;2,新型自制缓释bFGF微囊能明显促进新生血管的形成,效果优于相同剂量bFGF皮下注射,为微胶囊胰岛皮下移植创造了必要条件。第三部分受体皮下预血管化对微胶囊大鼠胰岛移植治疗糖尿病小鼠的影响目的:研究新型bFGF微囊皮下预血管化微胶囊SD大鼠胰岛皮下移植治疗化学性糖尿病小鼠的效果。方法:1,C57BL/6雄性小鼠,bFGF微囊小鼠背部皮下注射两周后,腹腔注射链脲霉素建立皮下预血管化化学性糖尿病小鼠模型,选取15只,随机分为3组,每组5只,行微胶囊大鼠胰岛背部皮下预血管化处移植。①A组:微胶囊大鼠胰岛移植组;②B组:大鼠胰岛移植组:③C组:空囊组。每周观察受体小鼠的血糖和体重变化。移植后8周,将糖尿病小鼠处死,行受体移植部位组织学研究。结果:1,A组血糖于移植后5天下降,7天下降至有效范围,并维持到实验结束时8周。B组血糖移植后明显下降,但未降至成模前正常小鼠非空腹血糖水平,移植3周后升至成模时血糖水平。C组和D组移植后血糖与成模时血糖相比较均无明显差异,移植无效;2,组织切片提示微胶囊囊壁完整,囊周无明显淋巴细胞浸润。结论:1,新型缓释bFGF微囊小鼠皮下预血管化大鼠胰岛移植可有效缓解化学性糖尿病小鼠高血糖状态,移植创伤小,可反复进行,而且具有观察容易、移植的微胶囊易回收和回收率高的特点;2,海藻酸钠微胶囊可有效保护囊内胰岛,为异种胰岛移植创造了必要的条件。第四部分大鼠胰岛与bFGF共微囊提高移植胰岛活性的实验研究目的:探讨bFGF与大鼠胰岛共微囊对提高皮下移植功效的作用。方法:选取C57BL/6雄性小鼠10只,建立皮下预血管化糖尿病小鼠模型,行微胶囊大鼠胰岛皮下移植。随机分为2组,每组5只。①A组:bFGF与大鼠胰岛共微囊移植组;②B组:微胶囊大鼠胰岛移植组。观察受体小鼠的血糖和体重变化,移植后8周将糖尿病小鼠处死,取出微胶囊,用双硫腙(DTZ)染色法判定和比较微胶囊内大鼠胰岛存活数。结果:A组和B组间各时间点小鼠血糖均无显著差异(P>0.05)。A组和B组间各实验点小鼠体重均无显著差异(P>0.05)。小鼠体重成模时下降,移植2周后开始上升,上升曲线与正常小鼠相似。B组、C组和D组糖尿病小鼠体重随移植后时间延长逐渐减轻。移植后8周后胰岛存活数,两组间有非常显著差异(t=8.22,P<0.01),bFGF共微胶囊大鼠胰岛移植组胰岛存活数较对照组多。结论:小鼠皮下预血管化bFGF与大鼠胰岛共微胶囊移植治疗化学性糖尿病小鼠可有效缓解化学性糖尿病小鼠高血糖状态,囊内bFGF的局部血管新生作用可明显提高微胶囊内胰岛存活率。第五部分大鼠胰岛与GF共微囊改善移植胰岛功效的实验研究目的:探讨GF与大鼠胰岛共微囊对提高囊内胰岛存活率的作用。方法:选取C57BL/6雄性小鼠皮下预血管化后建立糖尿病模型15只,行微胶囊大鼠胰岛皮下移植。随机分为3组,每组5只。①A组:GF与大鼠胰岛共微囊移植组;②B组:微胶囊大鼠胰岛移植组;③C组:GF微囊移植组。观察受体小鼠的血糖和体重变化,移植后8周比较微胶囊内胰岛存活数。结果:移植后1周至移植后3周A组与B组间血糖均有非常显著差异(P<0.01),移植后4周至移植后8周A组与B组间血糖无显著差异(P>0.05),移植后1周至移植后4周B组与C组间血糖均有非常显著差异(P<0.01)。C组血糖异常升高,移植4周后小鼠陆续死亡。A组和B组间各实验点小鼠体重均无显著差异(P>0.05),A组小鼠体重成模时下降,移植2周后开始上升,上升曲线与正常小鼠相似。A组和B组胰岛存活数有非常显著差异(F=36.84,P<0.01),大鼠胰岛与GF共微胶囊移植后8周胰岛存活数明显多于对照组。结论:GF与大鼠胰岛共微胶囊移植,GF可促进胰岛的细胞增殖和再生,显著提高囊内胰岛的存活率。移植后1周至移植后3周A组血糖较高可能是GH的缓释作用所致。第六部分大鼠胰岛与NGF共微囊提高移植胰岛存活率的实验研究目的:探讨NGF与大鼠胰岛共微囊对提高皮下移植胰岛功效的作用。方法:选取C57 BL/6雄性小鼠皮下预血管糖尿病模型10只,行微胶囊大鼠胰岛皮下移植。随机分为2组,每组5只。①A组:NGF与大鼠胰岛共微囊组;②B组:微胶囊大鼠胰岛组。观察受体小鼠的血糖和体重变化,移植后8周比较微胶囊内胰岛存活数。结果:A组和B组间各时间点小鼠血糖均无显著差异(P>0.05)。A组和B组间各时间点小鼠体重均无显著差异(P>0.05)。移植后8周将糖尿病小鼠处死,两组间胰岛存活数有非常显著差异(F=19.84,P<0.01),NGF共微胶囊大鼠胰岛移植组胰岛存活数较对照组多。结论:NGF与大鼠胰岛共微胶囊移植治疗糖尿病小鼠可有效缓解糖尿病小鼠高血糖状态,NGF可显著提高囊内胰岛的功能和胰岛存活数。
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