目的:神经节苷脂是具有唾液酸的糖脂，其在哺乳动物的神经组织中含量丰富，在神经细胞相互识别、神经组织发生、突触传导及细胞间信号传递等方面有重要作用。近年来许多学者报道抗神经节苷脂抗体与某些自身免疫性周围神经病有关，如格林－巴利综合征（GBS）。可能的机制为，包括空肠弯曲菌(脂多糖)在内的许多前趋感染的病原具有与神经节苷脂类似的结构，故针对病原的抗体与神经节苷脂有交叉反应，可于病人体内检测到抗神经节苷脂抗体。目前的研究结果提示特定神经节苷脂抗体与格林－巴利综合征特定亚型相关，如GD1a抗体与急性运动性轴索型格林－巴利综合征相关，GQ1b抗体与Fisher综合征有关，感觉性共济失调性神经病则与GD1b 抗体相关。不同神经节苷脂抗体与格林－巴利综合征不同亚型相关，提示抗体可产生特异的神经细胞损伤。这可能由抗体引起，或由神经节苷脂在神经组织中的分布不同造成。明确神经节苷脂在周围神经组织中的分布，对于阐明与神经节苷脂抗体相关的周围神经疾病的发病机制有一定意义。最直接的研究手段为应用病人血清分析神经节苷脂的分布，但正常人血清与周围神经同样有结合，而且目前对抗糖脂抗体的亲和纯化技术效率较低。以往报道的神经节苷脂的定位研究（主要针对GM1）多采用低亲和力的IgM抗体，或使用细菌毒素，如霍乱毒素B亚单位。此类试剂具有与GBS病人血清中IgG抗神经节苷脂抗体完全不同的性质，这些研究尚未阐明特定神经细胞易损性的机理。具有理想特异性及亲和力的IgG类抗神经节苷脂抗体因而成为研究GBS等疾病的有力工具。本实验的第一部分为制备IgG类抗神经节苷脂单克隆抗体。神经节苷脂为含有唾液酸的糖脂，糖链顺序及糖链构成的变化可以产生不同的神经节苷脂，如四种主要神经节苷脂GM1、GD1a、GD1b、GT1b和其它许多不同的神经节苷脂。产生针对神经节苷脂的特异性好亲和力高的抗体有一定难度。一些研究者在小鼠体内成功地制备了针对神经节苷脂<WP=4>的单克隆抗体，但主要是IgM型抗体，很少是IgG抗体。此类IgM抗体在科研工作中的应用受到了限制。有作者用GD1a与keyhole limpet hemocyanin (KLH)的耦联复合物免疫正常小鼠，以增强神经节苷脂的免疫原性，但只产生了较弱的IgM反应，并未产生IgG抗体。我们推测正常表达神经节苷脂的小鼠因缺乏对神经节苷脂敏感的T细胞克隆，故不能产生针对“自身”神经节苷脂理想的体液免疫反应。对神经节苷脂代谢的研究及遗传学技术进展为解决此问题提供了有力支持。通过分子生物学手段，将小鼠体内合成主要神经节苷脂关键酶的基因敲除（Knockout），此类Knockout小鼠不能合成GM1、GD1a、GD1b、GT1b这四种主要神经节苷脂，只表达GD3和GM3。该小鼠因体内无主要神经节苷脂，经神经节苷脂免疫后，可产生以IgG抗体为主的免疫反应，以便于制备针对特定神经节苷脂的高亲和力及特异性的单克隆抗体。除了作为制备抗神经节苷脂单抗的工具，此类基因缺乏小鼠也可用于研究抗神经节苷脂抗体是否只特异地结合周围神经中的神经节苷脂，而与糖蛋白无交叉反应。本研究应用细胞融合技术，通过免疫无主要神经节苷脂的Knockout小鼠，制备了9株针对主要神经节苷脂GM1、GD1a、GD1b、GT1b的IgG单克隆抗体和一株GM1 IgM单克隆抗体，利用共聚焦显微镜（Confocal）对周围神经系统和脊髓中神经节苷脂、神经纤维及神经细胞进行多重标记，描述了主要神经节苷脂GM1、GD1a、GD1b、GT1b在周围神经和脊髓中的分布及其与神经纤维、神经细胞类型的关系，并将神经节苷脂的免疫学定位方法与生物化学提纯结果进行对比，以探讨神经节苷脂抗体对周围神经特异性损伤的机制。方法:首先将神经节苷脂与KLH共价耦联以提高神经节苷脂的免疫原性。神经节苷脂在4-5双键处经O3氧化，引入单个醛基并释放出一个长链脂肪酸的醛基。醛化的神经节苷脂胺化后可产生稳定的胺基耦联的神经节苷脂—KLH。耦联反应产物在PBS内透析并经紫外分光光度计定量。薄层色谱（TLC）显示唾液酸的位置位于加样起点，说明KLH已与神经节苷脂共价耦联。高效薄层色谱（HPTLC）显示神经节苷脂的耦联效率近60%。我们将四种主要神经节苷脂与KLH耦联后免疫GalNAcT (-/-)小鼠（主要神经节苷脂基因敲除小鼠）。第1及第8天，小鼠接受50μg神经节苷脂KLH耦联物腹腔注射，13、14及15天，经鼠尾静脉注入<WP=5>10μg神经节苷脂KLH复合物。第16天，取小鼠脾细胞与P3X653细胞融合。融合后的杂交瘤细胞放于含HAT（次黄嘌呤、氨基比林、胸腺嘧啶脱氧核苷）的选择性培养基内，置于96孔细胞培养板中培养。经10天不间断培养，以ELISA（酶联免疫吸附试验）筛选产生特异性抗单一神经节苷脂IgG抗体的细胞集落。因IgM抗GM1抗体被报道与运动神经元病有关，故保留该株抗体。经反复筛选及有限稀释克隆，最终得到10株单克隆抗体细胞株。其中9株为特异性识别一种神经节苷脂的IgG抗体，1株为双特异性识别两种神经节苷脂的IgM抗体。IgG抗体的亚型包括IgG1、IgG2a和IgG2b。此10株单克隆抗体可做为研究神经节苷脂在神经组织中分布，神经节苷脂分布在生长发育中的变化及神经节苷脂在细胞粘附、识别及信号传导中作用的有力工具。我们采取体外中空纤