【摘 要】
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猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种危害养猪业的重要传染病,2011年以来在中国暴发的PR是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）变异毒株感染引起的。鉴于毒株的进化,许多学者开始探寻新PRV疫苗的研发。作为疱疹病毒科的成员之一,PRV是构建重组病毒活疫苗的良好载体,猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪
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猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种危害养猪业的重要传染病,2011年以来在中国暴发的PR是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）变异毒株感染引起的。鉴于毒株的进化,许多学者开始探寻新PRV疫苗的研发。作为疱疹病毒科的成员之一,PRV是构建重组病毒活疫苗的良好载体,猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪轮状病毒（Rotavirus,Po RV）感染引起的猪只腹泻性疾病对养殖业的损失惨重,尤以2010年以来PEDV变异毒株引起的仔猪腹泻为甚。本实验室在2018年以PRV-XJ亲本株利用同源重组技术成功构建了表达猪流行性腹泻-轮状病毒的重组伪狂犬病毒株（PRV-XJ△gE/gI-VP7.S）。该毒株在基因缺失部位插入重组了PEDV-S基因（475-804 aa）和PORV-VP7基因（17-339 aa）,共表达标记基因EGFP。TK是PRV的一个重要毒力基因,诸多研究报道该基因缺失后可能会进一步增强毒株的免疫原性。为了筛选有效的临床候选疫苗,本研究拟基于CRISPR/Cas9技术继续构建TK基因缺失的PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S毒株,并验证该毒株的部分生物学特性,包括遗传稳定性、增殖特性、动物安全性等。1.Lentcrispr-g1和Lentcrispr-g2载体的构建对PRV-XJ的TK基因进行全长扩增并测序,将其核苷酸序列上传至NCBI的Gen Bank数据库,利用DNASTAR7.1软件与其它已公布的28个PRV毒株信息进行同源对比,所有毒株核苷酸同源性为99.1%-100%,而PRV-XJ与2011年以后分离的中国株的同源性基本均为100%,遗传进化分析结果表明这些毒株同处一个分支。氨基酸序列分析显示中国毒株个别位点出现了一些突变。将PRV-XJ的TK基因CDS上传至（http://crispr.mit.edu）网站,根据得分排序筛选了两对gRNA。以Lenticrispr-V2载体为基础,最终构建了两个CRISPR载体,分别命名为Lentcrispr-g1和Lentcrispr-g2。2.PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S毒株的构建本研究采用转染后接毒的方式进行TK基因的缺失。以Lentcrispr-g2和实验室已构建好的PUC57-TK-RED同源供体质粒作为载体,将其共转染至BHK-21细胞（12孔板）。24 h后接种10μL的PRV-XJ△gE/gI-VP7.S,利用无限稀释法对病毒进行纯化。以Pcold-TF载体原核表达TK基因的550-960 bp,Ni-NTA柱纯化重组蛋白并免疫SPF昆明鼠3次,3免10 d后采集小鼠的血清作为一抗,PCR和Western-blot结果显示病毒的构建是成功的,并将其命名为PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S。3.PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S的部分生物学特性研究通过透射扫描电镜观察PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S和PRV-XJ在PK-15细胞中的形态,结果表明两种病毒的直径大小并无差异,均为80 nm。将PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S在BHK-21细胞连续传代21代次,PCR扩增表明TK基因的缺失是稳定的。病毒一步生长曲线显示PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S与亲本毒株PRV-XJ△gE/gI-VP7.S和PRV-XJ具有相似的生长动力学,但是同一时间PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S滴度是最低的,这种差异在第48 h后逐渐消失（P<0.05）,同时PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S形成的病毒噬斑最小。小鼠安全性实验表明PRV-XJ△gE/gI-VP7.S在小鼠中的LD50<2×103TCID50,而PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S的LD50>107TCID50,综上,可证明TK基因缺失后毒株的安全性显著提高。此外以5×106TCID50剂量的PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S免疫新生仔猪、断奶仔猪、保育猪、妊娠母猪,结果表明PRV-XJ△gE/gI/TK-VP7.S对猪只是安全的。
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