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本实验在实验室原有八棱海棠再生体系的基础上,主要采用了农杆菌介导法将IRT1基因转入八棱海棠中,获得了7个携带IRT1基因的八棱海棠株系。同时,本实验还初步探讨了利用超声波辅助农杆菌介导的方法在烟草和八棱海棠基因转化中的应用。研究结果如下: 1.超声波辅助农杆菌介导方法(SAAT Sonication-assisted Agnobacterium-mediated transformation)对模式植物烟草K326的基因遗传转化有非常明显的促进作用。在与单独用农杆菌侵染的对照的比较中我们发现,在农杆菌侵染的过程中辅助超声波处理,能获得100%的gus基因瞬时表达率,并且外植体的染色面积大多大于50%。在用SAAT法将外源基因导入烟草的过程中,超声波处理时间和处理强度是影响转化效率的最主要因素。比较实验发现,超声波处理的时间和强度应该适度。综合这两大因素,强度为80%的超声波处理40s能获得最高的瞬时表达率。另外,研究还发现,超声波处理时期也对外植体的转化效率有一定影响,认为在农杆菌侵染4min 40s后辅助超声波处理能获得最理想的转化率。 2.通过SAAT法在烟草转化中的运用,我们初步探讨了该种方法在目标植物八棱海棠转化体系中的应用前景。实验发现,适宜的超声波辅助处理能够比单独使用农杆菌更为有效地将外源基因导入到八棱海棠中去。实验结果表明,最佳处理是在农杆菌侵染4min 40s后辅助功率为70W的超声波处理20s,此时外植体的GUS瞬时表达率为60%,并且外植体的褐化率低于23.3%。另外,比较发现,叶柄通过超声波处理后比叶片和茎段的瞬时表达率高,并且对于超声波的耐受能力仅次于茎段。 3.实验分别用两种菌株同时侵染八棱海棠的叶片,两种菌株AT126和AT96分别获得了具有Km抗性的48个和12个株系,转化率分别为4.69%和0.10%。通过生根检测、GUS基因检测、PCR扩增以及RT-PCR检测等方法表明,IRT1基因已经整合到其中7个八棱海棠转化植株的基因组中,并在转录水平上得到了表达。