论文部分内容阅读
鸡球虫病是由一种或数种艾美耳球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内而引起的一种原虫寄生虫病,严重危害养鸡业。毒害艾美耳球虫（Eimerianecatrix）是鸡球虫病的重要病原之一,主要危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。目前,球虫病的防治主要依赖化学药物或鸡球虫病活疫苗。随着抗球虫药物的广泛与大量使用,球虫耐药性以及人们对药物残留肉蛋、污染环境等诸多问题也随之出现。同时活球虫疫苗又存在生产成本高、容易扩散病原、致弱虫株毒力易返强、虫株的抗原变异、疫苗导致饲料报酬降低、疫苗接种的剂量难以控制等弊端。因此,鸡球虫保护性抗原基因的筛选与克隆表达及其免疫保护力的研究一直是鸡球虫病研究的热点。为此,本文以毒害艾美耳球虫配子体为材料,构建毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库,并用免疫学方法从文库中筛选抗原基因,对ENH00080190基因进行了克隆表达和免疫原性分析,为研究毒害艾美耳球虫亚单位疫苗奠定基础。1毒害艾美耳球虫配子体的分离与纯化24日龄无球虫雏鸡,每鸡经嗉囊感染10 000个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。感染148 h后收取第二代裂殖子。经外科手术方法,将第二代裂殖子直接注入鸡盲肠内,使第二代裂殖子同步发育至配子体;手术后30 h剖检鸡,刮取盲肠黏膜,研磨后用0.5 mmol/L透明质酸酶消化,释放配子体;随后经过60目铜筛、260目锦纶筛兜和17 μm PET膜过滤,滤液经离心洗涤后用裂解液裂解红细胞;最后用30%和50%的Percoll,5 000 rpm离心15 min,分离纯化配子体。结果显示,本法获得的配子体纯度高、数量多,这为研究毒害艾美耳球虫配子体阶段的基因组学、蛋白质组学和免疫学等奠定了基础。2毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫配子体总RNA,随后采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫配子体cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,结果显示,总RNA的OD260/OD280值为1.95,样品的28S和18S条带清晰,原始文库容量为3.42×106 pfu/mL,重组率为90%,扩增后的文库容量为2.6× 1 010 pfu/mL,插入片段长度250～1000 bp。3毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的筛选首先,制备抗毒害艾美耳球虫的鸡康复血清和鼠抗毒害艾美耳球虫配子体多抗血清;两种血清经ELISA检测,显示两种多抗均有很高的效价;随后,用制备的鼠多抗对文库进行筛选,初次筛选共筛出疑似5个阳性克隆,复筛后确定阳性克隆3个;最后,对复筛后获得的阳性克隆进行PCR鉴定,对获得的EST序列进行生物信息学分析。结果显示,3个EST序列的长度分别为734 bp、270 bp和606 bp,分别编码毒害艾美耳球虫特有蛋白基因、毒害艾美耳球虫动力蛋白基因和毒害艾美耳球虫假定蛋白基因。4毒害艾美耳球虫动力蛋白基因表达及免疫原性分析首先,依据ENH00080190序列合成毒害艾美耳球虫动力蛋白基因,并将其插入到与载体pET-28a（+）连接,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。其次,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。最后,以毒害艾美耳球虫感染鸡康复血清为一抗进行Western-blot检测。结果显示,基因全长为270 bp,编码89个氨基酸;表达产物大小约为13 kDa,主要以包涵体形式存在;重组蛋白能被鸡康复血清识别,显示重组蛋白具有免疫原性。