随着关节软骨损伤发生率的增加，如何修复关节软骨成为了困扰临床治疗的难题，近些年来组织工程软骨的出现为软骨缺损的修复带来了新的希望。组织工程软骨包括四大因素，即种子细胞、支架材料、生长因子及生物反应器。但是如何将这些因素整合成为一体，如何将它们制作成形并应用于临床成为了研究人员试图解决的问题。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源广泛，能在一定的力学环境下向软骨细胞方向分化，可以作为修复关节软骨缺损的种子细胞，而细胞膜片技术可将所需种子细胞塑形，这就能够最大限度的获得移植细胞。富血小板纤维蛋白(plaletet-rich fibrin,PRF)作为一种富含血小板及白细胞的生物支架材料，不仅可以为种子细胞释放转移生长因子(transforming growth factor,TGF)-1、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-AB及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等多种细胞因子，还具有较好地促进组织再生的能力。本课题组前期采用发明专利技术将PRF膜片与BMSCs细胞膜片复合后构建成BMSCs/PRF双膜复合体移植材料，另外，我们还发现该复合体能够在适宜的压力条件下向成软骨方向分化，但是相关的机理不明。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen activated protein kinases,P38MAPK)是一种分布于细胞质内且具有丝氨酸及酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，它可被多种刺激因子激活，并参与细胞的形成、生长、分化等多种生理过程。有研究证明P38MAPK参与了力学刺激BMSCs成软骨过程，但是它是否参与力学刺激BMSCs细胞膜片中成软骨响应目前尚不清楚。NF-κB信号通路是细胞核内重要的信号通路，它同样能被多种刺激因子激活并参与细胞的多种生理反应。但是它是否参与软骨形成的过程并不明确，其与P38MAPK在力学信号转导过程中的上下游关系目前也存在争议。因此，本研究从分子生物学角度出发，研究压力刺激兔BMSCs/PRF双膜复合体后P38MAPK和NF-κB信号相关分子的表达，探讨P38MAPK和NF-κB信号通路在压力调控兔BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应过程中的具体作用及其信号转导途径。本实验共分为四个部分：实验一中，我们从新西兰大白兔股骨处抽取骨髓，利用密度梯度离心法分离纯化兔BMSCs，经过传代培养扩增后，成骨成脂诱导分化及流式细胞术鉴定我们提取的细胞是BMSCs。实验二与实验三中，抽取兔耳中央动脉血液10ml，以3000r/min离心10min获取PRF凝胶，并用无菌纱布包裹挤压制取PRF膜片。按照本课题组前期探索成功并申请国家发明专利的技术：一种干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜复合体移植材料的制备方法，将自体BMSCs膜片与自体PRF复合形成BMSCs/PRF双膜复合体，采用课题组自行研发制作的细胞液压加载装置，根据本课题组前期筛选出的对体外培养BMSCs/PRF双膜复合体能够产生良好促软骨向分化效应的生物力学刺激条件：120KPa、1h/d、连续4d静态液压加载。我们利用Western blot技术，检测120KPa不同时间点作用于BMSCs细胞膜片及BMSCs/PRF双膜复合体中P38MAPK和NF-κB信号通路相关分子蛋白表达情况，实验结果如下：(1)单纯PRF作用于兔BMSCs细胞膜片诱导0-120min，P38MAPK和NF-κB信号均未被激活。(2)120KPa压力作用于BMSCs细胞膜片或BMSCs/PRF双膜复合体15min后，P38MAPK磷酸化水平升高，而NF-κB信号通路中浆蛋白IκB、p-IκB (磷酸化IκB)和p-p65(磷酸化p65)及核蛋白中p65的表达量未出现明显变化，这说明压力刺激15min时只激活了P38MAPK通路；第30min时，NF-κB信号通路中浆蛋白IκB下调、p-IκB和p-p65上调及核蛋白中p65也同时上调，这说明压力刺激30min时细胞核内的NF-κB信号通路被激活；随后我们进行持续加压，发现在第60min时P38MAPK和NF-κB信号通路相关分子蛋白表达量最高，而60min以后，这两条通路表达量逐渐恢复正常。实验四中，根据P38MAPK和NF-κB信号通路相关分子最高蛋白表达量，我们选取120KPa，加压60min的实验条件，再利用抑制剂法探讨力学刺激BMSCs细胞膜片及BMSCs/PRF双膜复合体中P38MAPK和NF-κB信号通路之间的关系。我们发现P38MAPK抑制剂SB203580在抑制P38MAPK信号的同时也抑制了NF-κB信号通路，而NF-κB抑制剂PDTC在抑制了NF-κB信号的同时并未抑制P38MAPK信号通路，这意味着P38MAPK可能是NF-κB的上游信号分子。采用Realtime-PCR和Western blot技术对P38MAPK/NF-κB信号通路在压力调控BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应中的作用进行检测。结果显示：BMSCs细胞膜片及兔BMSCs/PRF双膜复合体在给予120KPa加压60min时，软骨细胞特异性指标Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ的蛋白水平及基因表达升高；给予P38MAPK抑制剂SB203580或NF-κB抑制剂PDTC后Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ的蛋白及基因表达水平降低。实验结论：课题组前期所证明的促BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应的生物力刺激条件为120Kpa、1h/d、连续4d的静态液压加载，且BMSCs/PRF双膜复合体组效果优于BMSCs细胞膜片组。进一步分析单次120KPa持续60min的静压加载下，BMSCs细胞膜片或兔BMSCs/PRF双膜复合体中P38MAPK和NF-κB信号通路信号分子表达最强，其成软骨蛋白及基因指标同时上升，但是PRF并不能激活BMSCs细胞膜片中P38MAPK和NF-κB信号通路。当阻断P38MAPK或NF-κB信号通路后，兔BMSCs细胞膜片及BMSCs/PRF双膜复合体成软骨方向分化能力同样被抑制。从而证实P38MAPK及NF-κB信号通路在压力促BMSCs/PRF双膜复合体软骨向分化过程中发挥着重要作用。